Técnicas de tipificación molecular del sistema HLA: RFLP, PCR-SSP, PCR-SSOP, Luminex y SBT

Técnicas de Tipificación Molecular del Sistema HLA

El estudio de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) es fundamental en el ámbito de la inmunología y los trasplantes. A continuación, se detallan las principales metodologías empleadas en el laboratorio:

RFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción)

Esta técnica se basa en la capacidad de las enzimas de restricción para reconocer determinadas secuencias de nucleótidos y cortar el ADN en los sitios de restricción específicos. Estos fragmentos resultantes se visualizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE).

PCR-SSP (Cebadores Específicos de Secuencia)

En este método, los cebadores (primers) utilizados para iniciar la PCR poseen secuencias complementarias a las secuencias específicas de ciertas variantes o "rarezas" que se tipifican en el sistema HLA. Se pueden emplear múltiples cebadores con la muestra de ADN, diseñados para que el extremo 3’ defina la especificidad de la secuencia diana.

• Cada reacción de PCR se realiza en un tubo separado, con un par de cebadores específicos y otro par de control interno.
• El producto se amplifica mediante PCR y se detecta a través de electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio, fotografiando el resultado bajo luz ultravioleta (UV).
• Si se produce la hibridación, se observa una banda que indica la presencia del alelo de HLA estudiado.

PCR-SSOP (Sondas de Oligonucleótidos de Secuencia Específica)

Consiste en la amplificación del ADN de toda una región mediante PCR. Posteriormente, este ADN se hibrida en una membrana de nailon con sondas de oligonucleótidos (ON) marcadas con biotina. Se añade un anticuerpo (Ac) conjugado con peroxidasa que se une a la biotina. Si se ha producido la hibridación, se genera luz al añadir fosfatasa alcalina a la mezcla.

Cada sonda es una cadena de ADN complementaria a otra de un HLA específico del antígeno (Ag). Existen dos variantes principales:

• PCR-SSOP directa: La sonda es la que se encuentra marcada.
• PCR-SSOP inversa o reversa: Variante en la que el componente marcado no es la sonda, sino el ADN durante el proceso de PCR.

Luminex: Tecnología de Microesferas y Citometría

Es una técnica que utiliza el fundamento de la PCR-SSO, pero las sondas están acopladas covalentemente a un conjunto de microesferas marcadas con dos fluorocromos. La hibridación se realiza en un tubo donde las perlas unidas a sondas específicas se hibridarán con el alelo específico en caso de estar presente.

Todo el complejo se analiza posteriormente mediante citometría de flujo. Esta técnica destaca por:

• Presentar un alto grado de automatización.
• Ser la tecnología más empleada hoy en día.
• Permitir tipificar los loci A, B y DR en un solo tubo por cada locus y dentro del mismo proceso.

SBT (Tipaje Basado en la Secuenciación)

Esta metodología implica la amplificación de la región HLA junto con la secuenciación directa del producto de la PCR. Es considerada casi imprescindible para los trasplantes de médula ósea. Para su ejecución, se puede utilizar ADN genómico o ADN complementario (ADNc).

A diferencia de las otras técnicas, el SBT aporta información detallada de la secuencia completa del gen, proporcionando una tipificación de alta resolución basada estrictamente en la secuencia nucleotídica.