Técnicas visualización

TINCION GRAMuno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM.Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica.  El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.  Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano.  La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.  En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico.  El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta.  De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación.  Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.  Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano).  La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.  Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.  Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1.El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. 2.La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. El proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.  3.Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada.  Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.

RODAMINA-AURAMINALos ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina.  Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

BLANCO DE CALCOFLÚOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.

TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN) Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas.  Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa.  Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés. La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.        Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

MEMBRANA CITOPLÁSMICA (CITOPLASMÁTICA O PROTOPLASMÁTICA) Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas empotradas.  La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de suma importancia.  Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado Mesosoma.

MORFOLOGÍA ULTRAMICROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS:ESTRUCTURAS EXTERNAS FLAGELOS Son apéndices filiformes, sumamente delgados, que sobresalen a través de la pared celular, y se originan, al parecer, en una formación granular situada inmediatamente debajo de dicha pared, en el citoplasma.  Hechos de una proteína llamada flagelina, consisten en un filamento y una región basal.  La región basal tiene un gancho y un cuerpo basal que tienen una vara y anillos. Los organismos Gram positivos tienen 2 anillos, uno en la pared de la célula y uno en la membrana de la célula.  Los organismos Gram negativos tienen 4 anillos, 2 en la pared de la célula y 2 en la membrana de la célula. No todas las bacterias poseen flagelos; de las bacterias pertenecientes al orden Eubacteriales, puede decirse en general, que muchas especies de bacilos tienen flagelos, pero éstos rara vez se encuentran en los cocos.  Naturalmente, esta generalización presenta excepciones. Como la motilidad de las bacterias se debe a los flagelos, y no todas las bacterias son flageladas, se deduce que hay especies móviles y especies no móviles.  Las bacterias flageladas presentan un patrón específico, tanto por el lugar de fijación como por el número de dichos apéndices. Este carácter se aplica a la clasificación de las bacterias en los órdenes Pseudomonadales y Eubacteriales; el primero incluye todas las bacterias con flagelos polares, y el segundo las que llevan flagelos peritricos. Los flagelos son demasiado pequeños para ser vistos en estado natural con el microscopio óptico. Sin embargo, con procedimientos especiales de tinción que emplean mordientes, aumenta su diámetro y se hacen visibles.  Tienen composición antigénica y química diferente al resto de la célula, por lo que provocan producción de Ac específicos.

MORFOLOGÍA ULTRAMICROSCÓPICA DE LAS BACTERIAS: ESTRUCTURAS INTERNAS    PARED CELULAR Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos, aminoazúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativa; el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver las dos imágenes juntas).

BACTERIA GRAM POSITIVA Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo

BACTERIA GRAM NEGATIVA Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme. Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tinción.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS MUESTRAS CLÍNICAS MUY MODIFICADAS TINCIÓN DIFERENCIAL Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. Los ejemplos clásicos serían la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen.

VIRUS  MÉTODO DE LA ORCEÍNA SHIKATA  Cuando en una biopsia encontramos los hepatocitos en aspecto de vidrio esmerilado, significa que el virus se está reproduciendo en él (infección aguda). Estos tienen la propiedad de captar la Orceína, coloreándose en marrón. Este es un método menos específico que la peroxidasa, pero es más económico. Es una técnica que puede hacerse de rutina. Resultados: Hepatocitos en replicación: citoplasma marrón /negro; El resto de la preparación se presenta sin color. Observaciones: Si utilizamos el verde luz, el fondo se verá verde claro; El tiempo de coloración será de 2 segundos máximo, para evitar el enmascarar la coloración de Shikata.

HONGOS Los hongos son células eucariotas que presentan: Membrana citoplasmática que contiene quitina, formada por N-acetil glucosamina y otros polisacáridos. Citoplasma que contiene mitocondrias y retículo endoplasmático. Membrana nuclear; Cromosomas; Ademásson heterotrofas, es decir, se nutren de compuestos orgánicos; Presentan pared rígida y su reproducción puede ser asexuada y sexuada; Unicelulares: como las levaduras; Pluricelulares: como los mohos, formadas por estructuras tubulares denominadas hifas, muy ramificadas y rodeadas de pared rígida.        La formación de las hifas se realiza: A partir de una espora que da lugar a un tubo germinal y éste a un filamento tubular.  La ramificación de las hifas forman una masa algodonosa y entrelazada de hifas secundarias y terciarias denominadas micelio. La parte del micelio que penetra en el sustrato se denomina micelio vegetativo y la parte libre micelio aéreo reproductor. Las esporas presentan dos membranas: Una interna denominada endosporina y otra externa, exosporina. La estructura, formación y pigmentación de las esporas ayuda mucho a la identificación de los hongos. Algunos hongos se originan a partir de la separación de parte del micelio, ocurriendo posteriormente la gemación. Es el caso de las levaduras. Otros hongos son dimórficos, es decir, pueden aparecen en forma de levadura o en forma micelial dependiendo de las condiciones donde se desarrollen.

METABOLISMO DE LOS HONGOS:Los hongos tienen escasas necesidades nutricionales por lo que pueden crecer fácilmente. El lugar más frecuente es el suelo, a temperatura entre 10 y 50ºC dependiendo de la especie, aunque algunos pueden crecer indistintamente a bajas o altas temperaturas. Por otra parte, su pH varía entre 4,5 y 8 y se ven favorecidos por cierto grado de humedad.  En medios de cultivo necesitan para crecer una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno.

COLORACIONES HISTOLOGICAS Los hongos se clasifican, por su morfología, en: Esporas, Hifas filamentosas y Filamentos de esporas.  Cuando, mediante la técnica histológica, queremos demostrar que existen hongos es muy difícil su identificación específica. En general los hongos son:    PAS +/Gram + …………hifas;       PAS + / Gram - ………..esporas;      Una de las técnicas más usadas para su demostración es la Técnica de Plata Metenamina que junto con el PAS, colorea los hidratos de carbono de las cápsulas.

Técnicas: HE: los micelios se ven con dificulad. Las esporas son basófilas;  PAS/PAS amilasa: se ven muy bien los núcleos. Las esporas son rojas;  Grocot.

TÉCNICA DE GROCOT Realizamos la impregnación con plata metenamina, Viramos con AuCl, Revelamos con tiosulfato sódico Resultados: Hongos, micelios y esporas: negro; Parte interna de los micelios: rosa; Mucina: gris oscuro; Fondo: verde claro

CITOPLASMA El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes, región citoplásmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, región nuclear o cromatínica, que es rica en DNA, y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos.  El RNA, combinado con proteínas, forma partículas o corpúsculos macromoleculares, de unos 200 A de diámetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma.  Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales.

ESTRUCTURAS CITOPLASMÁTICAS  NUCLEOIDE (CUERPO CROMATÍNICO) Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es único y circular, doble hélice sin proteínas. Como no se trata de un núcleo discreto, se ha sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el método de tinción de Feulgen, específico para el DNA, y por microscopia electrónica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante.   RIBOSOMAS Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S). PLÁSMIDOS Lazos extracromosómicos de ADN, algún código para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. ENDOSPORAS Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO DE LAS MUESTRAS CLÍNICAS SIN TINCIÓN No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS MUESTRAS CLÍNICAS LEVEMENTE MODIFICADAS TINCIÓN SIMPLE Se  utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos.  Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

CITOPLASMA El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes, región citoplásmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, región nuclear o cromatínica, que es rica en DNA, y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos.  El RNA, combinado con proteínas, forma partículas o corpúsculos macromoleculares, de unos 200 A de diámetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma.  Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales.

ESTRUCTURAS CITOPLASMÁTICAS  NUCLEOIDE (CUERPO CROMATÍNICO) Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es único y circular, doble hélice sin proteínas. Como no se trata de un núcleo discreto, se ha sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el método de tinción de Feulgen, específico para el DNA, y por microscopia electrónica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante.   RIBOSOMAS Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S). PLÁSMIDOS Lazos extracromosómicos de ADN, algún código para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. ENDOSPORAS Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO DE LAS MUESTRAS CLÍNICAS SIN TINCIÓN No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE LAS MUESTRAS CLÍNICAS LEVEMENTE MODIFICADAS TINCIÓN SIMPLE Se  utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos.  Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

MECANISMOS PARA LA PRODUCCIÓN DE ENERGÍA GLICOLISIS La Glucosa es fosforilada, desarmada y reorganizada en 2-3 compuestos de carbono que finalmente forman 2 ácidos pirúvicos, y en el proceso producen 2 ATP y 2 NADH.

FERMENTACIÓN Un paso adicional a la glicolisis donde el ácido pirúvico acepta electrones del NADH para formar ácido láctico, etanol, butanol etc. (dependiendo del organismo), mientras genera NAD+ por la glicolisis. La fermentación no produce ningún ATP más que los 2 ATP formados en la glicolisis.

RESPIRACIÓN AEROBIA En los procariotas tiene lugar en la membrana citoplásmica, mientras en los eucariotas sucede en la membrana mitocondrial interna. El ácido Pirúvico pierde un carbono como CO2 y se convierte en acetil. Al mismo tiempo NAD+ se reduce a NADH y se transfiere a la cadena de transporte de electrones. El Acetil combina con la enzima CoA para formar Acetil-CoA. El Acetil entra en el ciclo de Krebs para rendir 2 CO2, 3 NADH, 1 FADH2 y 1 GTP. Se transfieren NADH y FADH2 a la cadena de transporte de electrones, donde cada NADH produce 3 ATP y cada FADH2 producen 2 ATP.  En los procariotas la respiración aerobica rinde 38 ATP pero en los eucariotas el rendimiento es 36 ATP. En eucariotas 2NADH de la glicolisis tiene que ser transportada a las mitocondrias y eso requiere un ATP por NADH.

PROCESOS METABÓLICOS EN DIFERENTES ORGANISMOS Aerobios Obligados - La Glucosa es completamente oxidada a CO2 y H2O, requiriendo 21% de oxígeno. Microaerófilos - El proceso metabólico es similar al de los aerobios obligados, pero requiere 1-15 % de oxígeno. Anaerobios Facultativos - En presencia de O2, la glucosa es completamente oxidada a CO2 y H2O como en los aerobios obligados. En ausencia de O2, la glucosa sufre glicolisis a ácido pirúvico, entonces tiene lugar la fermentación. Anaerobios Obligados - La Glucosa sufre glicolisis a ácido pirúvico, entonces tiene lugar la fermentación o respiración anaerobia en la que el oxígeno no es el aceptor final de electrones. Algunos organismos usan nitrato, sulfato o carbonato.

PARASITOS

HE/PAPANICOLAU: Trichomonas, Trichina, Sarna

PAS: Para el Echinococcus granuloso (quiste hidatídico), Pneumocistis carinii , Giardia lambria, Ameba

METENAMINA PLATA: Pneumocistis carinii, Aspergillus

GIEMSA: Toxoplasma, Plasmodium