Tecnología del ADN Recombinante: Fundamentos, Vectores y Clonación Molecular

Proceso de Producción de ADN Recombinante

El procedimiento para producir ADN recombinante consta de los siguientes pasos:

1. Preparar el gen que se quiere clonar utilizando las enzimas endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las cadenas de ADN por secuencias específicas.
2. Preparar el vector de clonación con las mismas endonucleasas de restricción para que se originen los mismos extremos cohesivos en el vector.
3. Formar el ADN recombinante, mediante la acción de enzimas ligasas que unen el gen de interés al vector, a través de los extremos cohesivos.
4. Replicar el ADN recombinante (clonación del ADN) en la célula anfitriona (bacteria, levadura o célula tumoral). Para ello, es necesario introducirlo en la célula (por transformación, microinyección, pistola de genes, etc.) y propagar el cultivo, induciendo la división celular.
5. Seleccionar los clones recombinantes, que son reconocidos porque el vector, además del gen a clonar, porta un gen marcador.

Fundamentos de la Tecnología del ADN Recombinante

Por lo tanto, la tecnología del ADN recombinante depende de la capacidad de cortar (endonucleasas o enzimas de restricción) y unir (ligasas) segmentos de ADN por determinadas secuencias de bases, así como poder amplificar, aislar e identificar segmentos particulares de ADN que después se pueden transferir a otros organismos.

Preparación del Gen y Vectores

Preparación del Gen a Clonar: Utilización de Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción son endonucleasas aisladas de bacterias. Estas enzimas reconocen una secuencia específica de nucleótidos de una doble hélice de ADN, denominada la secuencia de reconocimiento, y cortan esa secuencia.

Algunas reconocen secuencias palindrómicas: la secuencia de una de las cadenas del ADN, leída en sentido 5' → 3', es la misma que la secuencia de la cadena complementaria leída también en sentido 5' → 3'. Estas enzimas cortan el ADN dejando extremos de cadena sencilla, denominados extremos adherentes o cohesivos.

Vectores de Clonación: Definición y Características

Los vectores de clonación son moléculas de ADN que sirven para transportar genes. Para servir de vector deben tener las siguientes características:

• Replicarse independientemente junto con el ADN que transportan.
• Contener un sitio de corte para enzimas de restricción, que se utiliza para insertar el ADN cortado con la misma enzima.
• Tener algún marcador de selección, por ejemplo, genes de resistencia a algún antibiótico o genes para fluorescencia, para poder seleccionar las células modificadas.

Se usan como vectores: bacteriófagos, plásmidos, algunos virus y cósmidos (híbridos construidos con partes del cromosoma de un fago y de ADN de un plásmido).

Los vectores de clonación deben ser cortados con la misma enzima de restricción que el gen que se quiere clonar para que, posteriormente, hibriden (se unan por puentes de hidrógeno) y originen el ADN recombinante.

Obtención de Múltiples Copias (Amplificación)

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Esta técnica utiliza una enzima ADN polimerasa termoestable, cebadores y nucleótidos de A, G, C y T. La máquina donde se realiza se llama termociclador. Las tres etapas fundamentales son:

1. Desnaturalización: Por calor del ADN que se quiere amplificar, separándolo en cadenas sencillas.
2. Hibridación: De los cebadores con el ADN de cadena sencilla. Se consigue al bajar la temperatura, ya que los cebadores son sintéticos y cada uno de ellos tiene la secuencia complementaria a uno de los extremos de las cadenas sencillas del ADN.
3. Síntesis de ADN: Por una polimerasa resistente al calor, que alarga los cebadores en sentido 5' → 3'.

Clonación Molecular (Clonación Génica)

También se denomina clonación génica, y consiste en la formación de múltiples copias de un determinado fragmento de ADN, mediante el poder de replicación de los organismos vivos. Es necesario que se introduzca el ADN recombinante en células huésped, donde se replicará formando nuevas copias.