Tipos de cromatografía: técnicas de separación y sus fases
Cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación que utiliza dos fases: una fase móvil (disolvente líquido o gas) y una fase estacionaria (soporte sólido o líquido). Hay que tener en cuenta la selectividad, es decir, la capacidad de discernir entre dos métodos analíticos. Si la técnica no es selectiva, se usa un método de separación.
La muestra se introduce en la fase móvil y sus componentes se distribuyen entre las dos fases en función de sus propiedades físico-químicas.
Clasificación
- Según el estado físico de la fase móvil: líquida (cromatografía de líquidos) o gaseosa (cromatografía de gases).
- Según la propiedad físico-química de separación: solubilidad, tamaño, carga eléctrica, hidrofobicidad o interacciones (biológicas o inespecíficas).
- Según el tipo de soporte: superficie plana o columna.
En superficie plana
La fase estacionaria es polar y la fase móvil apolar. La cámara se llena de disolvente hasta el nivel de la muestra. Los analitos se separan: primero asciende el más hidrofóbico y después el más hidrofílico.
Rf = distancia que avanza la molécula / distancia que avanza el frente del disolvente.
Cromatografía en papel
Soporte: celulosa (papel de filtro). Fase estacionaria: líquido absorbido por el papel. Fase móvil: líquido, disolvente orgánico. Las moléculas hidrofílicas son solubles en la fase estacionaria y se desplazan lentamente; las hidrofóbicas se disuelven en la fase móvil y se desplazan rápidamente.
Cromatografía en capa fina
Soporte: placa de metal o vidrio. Fase estacionaria: sólido pulverizado sobre la placa (el más utilizado es el gel de sílice). Fase móvil: líquido (disolvente orgánico). Las moléculas hidrofílicas se retienen por la fase estacionaria y avanzan lentamente; las hidrofóbicas, disueltas en la fase móvil, avanzan rápidamente.
Cromatografía en columna
La fase estacionaria se empaqueta en una columna. La muestra se deposita en la parte superior y, por gravedad, se añade la fase móvil para realizar la separación. Los analitos se van extrayendo: primero sale uno y después otro.
Por absorción
Filtración en gel
Propiedad: tamaño. Soporte: resina particulada porosa, esférica, de polímero hidrófilo. Fase estacionaria: disolvente acuoso dentro de las microparticulas. Fase móvil: disolvente acuoso que atraviesa la columna entre las microparticulas.
Se coloca la muestra y se añade fase móvil, que empuja la muestra. Las moléculas más grandes son eluidas primero (mayor velocidad entre las bolas) y las más pequeñas después (penetran en los conductos de las bolas y avanzan más lentamente).
Intercambio iónico
Propiedad: carga eléctrica. Soporte: micropartículas de polímeros sintéticos o naturales. Fase estacionaria: sólido con grupos con cargas iónicas. Si los grupos son positivos, se trata de cromatografía aniónica; si son negativos, de cromatografía catiónica.
Fase móvil: líquido que anula las interacciones electromagnéticas. Se pueden emplear dos tipos de gradientes: gradientes de pH (cambian la carga de las moléculas) o gradientes iónicos (competencia con los grupos electrofílicos). Menor carga en la fase móvil implica mayor retención en los grupos cargados de la fase estacionaria.
Afinidad
Propiedad: interacción específica entre dos moléculas: hormona/receptor, enzima/sustrato, antígeno/anticuerpo. Soporte: matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga. Fase estacionaria: sólido con ligandos unidos a la matriz. Fase móvil: líquido en solución que reduce la afinidad con el ligando, permitiendo liberar la molécula retenida.