Vectores de Expresión y Genotecas: Conceptos y Aplicaciones

Vectores de Expresión

Cuando queremos insertar un nuevo gen en un determinado sistema celular con interés comercial o experimental, debemos hacerlo mediante la construcción correcta de un vector de expresión. Se puede definir como una construcción genética que permite la introducción de un gen exógeno determinado en una célula diana que sea capaz de expresarlo eficientemente. Sus elementos básicamente serían:

• Origen de replicación autónomo
• Promotor del gen de interés
• Región de clonaje múltiple donde vamos a insertar el gen de interés
• Gen de selección
• Secuencias génicas reguladoras

Los promotores pueden ser constitutivos, histoespecíficos o inducibles.

Sitio de Clonaje Múltiple

El sitio de clonaje múltiple del vector es una región del ADN del vector de expresión provista de varias dianas únicas para diferentes enzimas de restricción. Gracias a estos vectores podemos obtener transgénicos. Podemos ser capaces de introducir genes de interés en células que en condiciones naturales no lo tendrían, y así generar productos nuevos con mayor facilidad, para purificarlos y comerciarlos, optimizar los procesos de producción industrial o generar microorganismos con nuevas características de interés que aporten beneficios.

Genoteca Genómica

Producidas cuando el genoma completo de un organismo se corta en millares de fragmentos mediante enzimas de restricción que efectúan cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada del genoma. Se produce una digestión parcial del genoma. Se genera así una colección de genes superpuestos con una longitud idónea para ser clonados. Los fragmentos grandes o demasiado pequeños para ser clonados se eliminan mediante electroforesis o por centrifugación. Tras ligar el vector y el fragmento de ADN se introduce en una célula huésped.

CDNs

Contiene copias de ADN complementario del ARN mensajero presente en un determinado tejido. El clon obtenido contiene solamente exones de un gen, y por lo tanto es una representación directa de la secuencia codificante de un gen, sin los intrones ni otras secuencias promotoras.

Genotecas de Expresión

Similares a las CDNA pero tienen además del exón, señales de transcripción y traducción necesarias para la regulación de la expresión del gen clonado. Se usan para la producción de proteínas transgénicas. Además, se pueden añadir etiquetas que faciliten la identificación de la proteína una vez sintetizada.

La PCNA se encuentra en grandes cantidades en las células en proliferación. Su estructura tridimensional es muy parecida a la estructura B de la procariota y su función es similar, ya que forma una abrazadera circular que potencia mucho la procesividad de la polimerasa. La E estaría más relacionada con reparación y eliminación de cebadores. Intervienen dos complejos: el RPA, que equivale a las SSB, y el RFC, que es un cargador de la abrazadera para la PCNA. El inicio más complejo, el sistema de control del ciclo es un dispositivo bioquímico las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas que inducen y coordinan los procesos básicos del ciclo como la duplicación de ADN y división celular. Ori (20/80) sobre cada lazo de cromatina y se caracterizan por poseer una secuencia común denominada ARS formada por dos secuencias GAGGC. El segundo componente del complejo pre R es la proteína CDC6P que se sintetiza en G1 e inserta los orígenes de replicación. Al inicio de la fase S se induce la apertura de los orígenes de replicación, activando a las moléculas responsables de la síntesis de ADN e induciendo la separación del complejo pre R. Separando este se inicia la síntesis. Los cromosomas a partir de este momento se denominan post-replicativos.

Terminación

Los organismos eucariotas poseen cromosomas lineales en los cuales se presenta el problema de su acortamiento durante la replicación, debido a que el eliminar el cebador de los fragmentos de Okazaki del extremo 5´de la cadena retardada del telómero del nuevo cromosoma lineal, se produce un hueco que no puede ser rellenado por acción de la DNA polimerasa, puesto que solo funciona en dirección 5'3' y necesitan un extremo 3' OH.