Ventajas y aplicaciones de la PCR en la clonación molecular
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Ventajas de la PCR frente a otras técnicas de BM
La PCR es una técnica de amplificación que ofrece ahorro de tiempo y automatización completa en comparación con las técnicas de clonación en vectores mediante tecnología de ADN recombinante.
Uso de cebadores en las técnicas de PCR
Los cebadores son clave para realizar una amplificación específica con éxito. La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental para cada pareja.
Tipos de ADN polimerasas usados en la PCR
Existen diferentes tipos de ADN polimerasas termoestables con distintas actividades exonucleasas.
Parámetro que condiciona la temperatura de hibridación de una PCR
La temperatura de hibridación se realiza habitualmente a una temperatura de entre 50°C y 65°C, dependiendo de los cebadores y suele estar comprendida en el rango tm ± 5°C.
Reactivos de una mezcla master de PCR
La mezcla master de PCR contiene tampones, agua estéril MQ, Taq ADN polimerasa, cebador, MgCl y dNTPs.
Criterios de calidad del ADN molde de una PCR
El ADN molde debe cumplir con un alto grado de integridad y una concentración A260/A280 entre 1,7 y 2,0 para garantizar que no está contaminado con proteínas y otros contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR.
Fase de desnaturalización inicial de un termociclador
Es la etapa que inicia la reacción de PCR, consiste en calentar la mezcla de reacción a 94-95°C durante varios minutos para asegurar la completa desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la mezcla de reacción.
Resultado positivo en una PCR
En cada tanda de PCR se procesa un control negativo o blanco en el que el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR.
Variaciones para realizar una PCR de alta fidelidad
Se requiere la utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora y ajustar las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima.
Requisitos de los cebadores de una PCR múltiple
La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser similar, y deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros u oligómeros.
Características de un termociclador a tiempo real
Permite la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra de forma rápida y minimiza los problemas de contaminación.
Medición de la fluorescencia en una PCR a tiempo real
Se mide en la fase de hibridación utilizando un sistema de detección específico de secuencia por balizas moleculares.
Concepto de Cp en una qPCR
Es el punto de corte de una PCR cuantitativa a tiempo real.
Concepto de curva de fusión de una qPCR
Es una gráfica que representa la fluorescencia frente a la temperatura.
Clonación molecular de ADN
Es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN basada en la tecnología de ADN recombinante.
Polylinker de un vector de clonación
Es un segmento corto donde se concentran todas las dianas de restricción.
Composición de un fagémido
Está compuesto por un plásmido de origen bacteriano al que se le inserta un fago M13.
Levadura más usada como célula hospedadora en las técnicas de clonación molecular
Es la S. cerevisiae.
Preparación de una secuencia de ADN de un solo gen para clonarla
Se amplifica el ADN con PCR utilizando polimerasas sin actividad correctora.
Digestión enzimática de un vector circular de ADN con dos dianas de restricción
Tras la digestión enzimática se obtienen dos moléculas lineales con extremos cohesivos.
Electroporación
Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución.
Tasa de transformación en una clonación
La transformación consiste en la captación e internalización por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo.
Selección e identificación de los clones recombinantes de interés
Se realiza simplemente cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico en cuestión.
Tipos de biblioteca de ADN
Existen bibliotecas genómicas, cromosómicas y de ADNc.
Aplicaciones de la clonación molecular en el ámbito industrial
Se aplica en el ámbito médico y farmacéutico, en la industria química y de la alimentación, y en el ámbito medioambiental.