Enzimas de Restricción: Tipos y Aplicaciones en ADN

Clasificación de las Nucleasas

Las nucleasas son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante la hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos. Se clasifican según:

• Ácido que atacan: ARN o ADN.
• Cadena que atacan: Molécula bicatenaria o monocatenaria.
• Tipo de corte:
  • Exonucleasa: Elimina nucleótidos de un extremo.
  • Endonucleasa: Corta en puntos intermedios.
• Especificidad: Cortan aleatoriamente o en sitios concretos.

Endonucleasas de Restricción

Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario y producen un corte en la doble cadena. Existen varios tipos:

• Tipo I: Reconocen su diana y efectúan un corte en una región anterior o posterior de la diana hasta 1000 pares de bases. No generan un patrón específico.
• Tipo II: Reconocen la diana y cortan en sitios específicos. No metilan el ADN. No necesitan ATP, pero sí Mg²⁺. Cortan de manera predecible.
• Tipo III: Reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana.

Las enzimas de tipo I y III cortan y metilan el ADN, y necesitan ATP.

Factores que Afectan a las Endonucleasas de Restricción

Los factores que afectan a la actividad de las endonucleasas de restricción incluyen la pureza del ADN y la presencia de sales que pueden inhibir su acción.

Tipos de Corte

Las endonucleasas de restricción pueden generar dos tipos de corte:

• Extremos romos: El corte se produce en el mismo punto en ambas cadenas.
• Extremos cohesivos: Los cortes se producen en puntos distintos en ambas cadenas, generando extremos complementarios.

Creación de ADN Recombinante

Para crear ADN recombinante, se cortan dos moléculas distintas con la misma enzima de restricción, se mezclan los fragmentos de extremos cohesivos y las mellas de la cadena se unen con una ligasa.

Otros Conceptos Importantes

Patrón

Conjunto de bandas útiles para la identificación de muestras de un mismo individuo.

Isoesquizómero

Enzimas endonucleasas de restricción obtenidas de distintas especies que reconocen la misma diana. La primera enzima descubierta de la familia es el prototipo.

Neoesquizómero

Endonucleasas de restricción que reconocen la misma secuencia pero cortan en un sitio distinto.

Clonación

Insertar un gen en plásmidos con las mismas enzimas de restricción.

Plásmido Recombinante

Plásmido en el que se ha insertado un gen.

ADN Polimerasa

Enzima que realiza copias de ADN por replicación. Usa enzimas de tipo I y III. Se diferencian por la velocidad de polimerización, fidelidad de replicación, termoestabilidad y procesividad.

Retrotranscriptasa

ADN y ARN polimerasa que sintetiza ADN con ARN como molde. Permite realizar estudios de ARN y su amplificación.

TdT

ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxinucleótidos en el extremo 3' de una cadena de ADN.

Ligasa

Une dos moléculas de ADN.

Topoisomerasa

Relaja la tensión de la doble hélice del ADN.

Pretratamiento y Extracción de ADN

Pretratamiento

• Sangre: Lisis celular o separación de la fracción mononuclear.
• Cultivos: Suspensión celular o monocapa.
• Tejido: Homogeneización mecánica (automatizada o con mortero) o química.
• Otros: Bacterias, virus, esputo, muestras orales.

Extracción

• Solución de lisis: Detergente, EDTA, proteasa, agente caotrópico.
• Rotura de la pared celular: Enzimas como lisozima o liticasa, métodos mecánicos o CTAB.

Purificación

• Solvente orgánico: Eliminación de componentes solubles, precipitación del ADN, lavado y resuspensión.
• Salting out: Precipitación de proteínas, separación del ADN, lavado y resuspensión.
• Cromatografía de intercambio iónico: Unión electrostática entre iones y grupos funcionales. Se utiliza una columna cargada, se lava y se eluye el ADN.
• Absorbancia: Capacidad de absorción del ADN al vidrio o sílice en presencia de sales caotrópicas. Se carga la columna, se lava y se eluye el ADN en un tubo Eppendorf.
• Esferas magnéticas, ultrafiltración: Para eliminar productos que interfieren en la PCR. Retención por tamaño. Conserva el ADN a largo plazo (papel FTA).

Calidad del ADN

• Integridad: Conserva el tamaño original.
• Pureza:
  • ADN: 1,6/1,7-2,0/2,0
  • ARN: 1,8-2,1
  • A₂₃₀: 1,5 y 1,5-2,2

Concentración del ADN

• ADN de doble cadena (dsDNA): 50 µg/mL
• ADN de cadena sencilla (ssDNA): 33 µg/mL
• ARN: 40 µg/mL

Procedimiento de Electroforesis Capilar (EC) en ADN

Se rellena el capilar de ADN. Los extremos del capilar se colocan en dos viales de tampón. Se aplica un alto voltaje. Se inyecta la muestra en el cátodo. Se reemplaza el vial por el de entrada. Se aplica el potencial eléctrico. Los analitos se detectan en la ventana del capilar mediante marcadores fluorescentes. El método más usado son los primers.

Polo positivo (ánodo): Carga negativa, fragmentos pequeños.

Polo negativo (cátodo): Carga positiva, fragmentos grandes.

Polimorfismos

• Microsatélites (STR): 2-6 pb, hasta 500 repeticiones.
• Minisatélites (VNTR): 6-25 pb, miles de repeticiones.
• Satélites: 200-2000 pb, varias repeticiones.
• Long interspersed nuclear elements (LINEs): Incluyen STR, microsatélites, VNTR, minisatélites, CNP y satélites. Variación en la secuencia de un locus.
• Secuenciación: SNP (90% de las variaciones). Variación en la secuencia de un locus.

Aplicaciones

VNTR

Digestión del ADN purificado, separación por electroforesis, transferencia a una membrana de nitrocelulosa, hibridación de la membrana con una sonda, autorradiografía. MLP (sonda multilocus) o SLP (sonda monolocus).

STR

Amplificación por PCR, separación por electroforesis, obtención de cariotipos, comparación de bandas.

STR con Poliacrilamida

Extracción y purificación del ADN, PCR de los STR, electroforesis, estudio estadístico.

Electroforesis Capilar

Extracción y purificación del ADN, PCR múltiple, electroforesis capilar con escalera, análisis estadístico.