Hemocultius: Protocol d'Identificació de Microorganismes

Protocols d'Identificació en Hemocultius

Bacterièmia

• Definició: Presència de bacteris a la sang detectada mitjançant hemocultiu (cultiu de sang).
• Quantitat de microorganismes: Normalment baixa (10-10⁴ UFC/ml - Unitats Formadores de Colònies per mil·lilitre), per això es necessiten tècniques molt sensibles per al diagnòstic ràpid.
• No és sinònim de sèpsia: La bacterièmia pot existir sense que es produeixi una sèpsia, ja que la infecció pot ser localitzada.

Sèpsia

• Definició: Estat inflamatori anòmal causat per una infecció, que porta a disfunció orgànica per la resposta inflamatòria.
• Efectes: Provoca hipotensió i hipoperfusió tissular (manca d’oxigen als teixits). Si la sèpsia es perllonga, pot evolucionar a xoc sèptic, amb hipotensió greu, alteracions circulatòries, cel·lulars i metabòliques greus, i fallida multiorgànica.

Microorganismes Freqüents en Hemocultius (Positius Reals)

Patògens Comuns (90% dels casos)

Procedents d'infeccions prèvies en una localització diferent de la sang.

• Staphylococcus aureus
• Enterobacteris (especialment Escherichia coli)
• Streptococcus pneumoniae

Flora de la Pell (5% dels casos)

Infecció iniciada a la sang, sovint a través de catèters intravenosos contaminats.

• Estafilococs coagulasa negatius
• Streptococcus viridans

Microorganismes Contaminants (Falsos Positius)

Contaminació durant l’extracció de l’hemocultiu; el microorganisme no està causant bacterièmia.

• Staphylococcus coagulasa negatius són els més comuns com a contaminació.

Obtenció de Mostra per a Hemocultius

• Composició: Cada hemocultiu consta de 2 flascons: 1 aerobi i 1 anaerobi.
• Probabilitat de recuperar microorganismes:
  • 1 hemocultiu (2 flascons): 60-80% de probabilitat de recuperació.
  • 2 hemocultius (4 flascons): 80-90% de probabilitat.
  • 3 hemocultius (6 flascons): 95-99% de probabilitat.
• Procés habitual (2 hemocultius): Normalment es recullen 2 hemocultius (4 flascons), un durant el primer pic febril i un altre en el segon.
• Pacients hospitalitzats: Els hemocultius s'extreuen de la via ja posada, cosa que pot augmentar la possibilitat de falsos positius per contaminació.
• Tècnica estèril: És molt important seguir una tècnica estèril per evitar contaminacions i obtenir resultats fiables.

Contaminacions en Hemocultius (Falsos Positius)

• Índex de contaminació: Es considera un indicador de qualitat assistencial. Idealment, no hauria de superar el 3% dels hemocultius rebuts, però pot representar fins a un terç dels cultius positius.
• Bacteris contaminants més comuns:
  • Staphylococcus coagulasa negativa
  • Bacillus spp.
  • Altres bacteris de la flora de la pell
• Paràmetres per identificar falsos positius:
  • Nombre d'extraccions positives: Si només una de les dues extraccions és positiva, és probable que sigui un fals positiu.
  • Lloc d'extracció: Si la mostra prové d’un catèter, la possibilitat de fals positiu augmenta.
  • Temps fins al resultat positiu:
    • ≤ 15 hores: Positiu generalment indica microorganisme amb valor clínic.
    • ≥ 22 hores: Pot indicar contaminació.

Identificació Preliminar de Contaminants

Alguns microorganismes, com Corynebacterium sp. i Propionibacterium acnes, rarament indiquen bacterièmia real.

Incubació d'Hemocultius (Sistemes Automatitzats)

• Agitació contínua: Els flascons d'hemocultiu s'introdueixen en el sistema que manté una agitació contínua a 37 ºC.
• Lectura cada 10 minuts: El sistema realitza lectures continuades per detectar la presència de microorganismes.
• Mesura de CO₂: El CO₂ generat pel metabolisme bacterià interactua amb un substrat (fluorescent o cromogènic), i el fotosensor mesura la fluorescència. Si el nivell de fluorescència arriba a un llindar determinat, l'aparell emet una alarma per indicar un resultat positiu.
• Temps d'incubació:
  • La major part dels microorganismes creixen entre 18-72 hores.
  • Si el cultiu és negatiu: La incubació es manté fins a 5-7 dies per garantir que no hi ha creixement bacterià.
  • Sospita de Brucella: Si es sospita una infecció per Brucella, la incubació es manté durant 14 dies per assegurar-se que es detecta qualsevol possible creixement.

Processament d'Hemocultius Positius

1. Desinfecció inicial: Es desinfecta el tap del flascó amb gasa estèril i alcohol per evitar contaminacions externes.
2. Mètode d’extracció: Es separen 5 mL de sang en un tub cònic per centrifugar. S’obté un pellet (precipitat) que es fa servir per a la identificació directa mitjançant MALDI-TOF.
3. Tinció i observació: Es fa una extensió per tinció de Gram per observar els morfotipus dels microorganismes.
4. Sembra en medis específics: Es realitza la sembra utilitzant 1 gota de la mostra en diversos medis:
   • Agar sang: Cultiu general.
   • Altres plaques segons els resultats del Gram.

Plaques Addicionals segons Tinció de Gram

• Bacils Gram (-): Sembra en Agar MacConkey en aerobiosi.
• Cocbacils Gram (-) (possibilitat d’Haemophilus): Sembra en agar xocolata amb atmosfera de CO₂.
• Cocs Gram (+):
  • Sospita d’Enterococcus: Afegir tub bilis esculina.
  • Diplococs: Afegir disc Optoquina per diferenciar Streptococcus pneumoniae vs grup viridans.
  • Cadenes llargues de cocs: Afegir disc Bacitracina per diferenciar Streptococcus grup A vs grup B.

Mètodes d’identificació més comuns i eficients: El MALDI-TOF per a la identificació directa i la tinció de Gram per identificar morfotipus de manera ràpida.

Medi més utilitzat: Agar sang, ja que és un medi universal per a molts patògens comuns. L’ús d’altres medis (com MacConkey, Agar xocolata, o discs específics) depèn de les sospites derivades de l’observació inicial (Gram).

Identificació Específica addicional

• Diplococs Gram (-) (Sospita de Neisseria): Utilitzar Agar Thayer Martin amb atmosfera de CO₂ per a una millor recuperació de Neisseria i altres bacteris fastidiosos per l'oxigen.
• Si es detecten Gram (+) i Gram (-) alhora:
  • Agar sang amb CNA (colistina i àcid nalidíxic): Aquesta combinació d'antibiòtics inhibeix els BGN (bacteris Gram negatius), permetent la identificació de CGP (cocs Gram positius).
  • Agar MacConkey: Inhibeix els CGP (cocs Gram positius) per identificar BGN (bacteris Gram negatius).
• Presència de llevats: Si es sospita de llevats, sembrar Agar Sabouraud que és específic per al creixement d'aquests microorganismes.

Identificació Directa amb MALDI-TOF

Protocol validat pel SEIMC:

1. Centrifugar 5 mL d'hemocultiu a 1000 rpm durant 10 minuts per separar les cèl·lules sanguínies.
2. Traspassar el sobrenedant a un nou tub i centrifugar a 4000 rpm durant 15 minuts per obtenir el pellet.
3. Descartar el sobrenedant i utilitzar el pellet per obtenir la mostra que es col·locarà directament a la placa MALDI-TOF.

Avantatges de la identificació amb MALDI-TOF:

• Permet accelerar la identificació en 24 hores.
• Ideal per a cultius monomicrobians.
• Si hi ha més d'un microorganisme, no es pot obtenir un espectre vàlid perquè el MALDI-TOF detecta només un microorganisme a la vegada.

Resultat concloent: Si el resultat és vàlid, es considera com a identificació significativa i es realitza l'antibiograma a partir del pellet.

Identificació a partir de Creixement en Placa

• Mètodes manuals: Proves bioquímiques per identificar microorganismes, com el sistema API que permet identificar els patògens per les seves reaccions bioquímiques.
• Sistemes automatitzats: Aquests sistemes poden identificar el microorganisme de forma més ràpida i eficient, reduint el temps d'anàlisi i millorant la precisió.

Mètode més comú i eficient: El MALDI-TOF és un mètode potent per identificar ràpidament microorganismes en cultius monomicrobians, estalviant temps en la identificació en 24 hores i proporcionant resultats més precisos en comparació amb mètodes manuals.

Medis específics d'ús comú:

• Agar Thayer Martin per Neisseria.
• Agar MacConkey i Agar sang amb CNA per diferenciar entre Gram negatius i Gram positius.
• Agar Sabouraud per identificar llevats, que és un pas clau quan es detecta la presència de llevats.