Hibridació d'Àcids Nucleics i Tipus de Sondes Moleculars

Conceptes Fonamentals d'Hibridació i Desnaturalització

1. Quin nom rep la unió de dues molècules monocatenàries d’àcids nucleics, originant una molècula híbrida bicatenària?
   c. Hibridació.
2. Què és una seqüència diana?
   a. La seqüència concreta d’àcids nucleics que es pretén detectar en la mostra problema.
3. Què és una sonda?
   d. La cadena de nucleòtids la seqüència de bases nitrogenades de la qual és complementària a la seqüència diana.
4. Quin nom rep la propietat de l’ADN consistent en la separació de les dues cadenes d’una molècula bicatenària per ruptura dels ponts d’hidrogen entre les bases nitrogenades complementàries?
   a. Renaturalització. (Nota: La definició correspon a Desnaturalització)
5. Què és la corba de fusió de l’ADN?
   b. Una corba sigmoide, obtinguda mesurant l’absorbància a 260 nm d’una solució d’una molècula bicatenària d’ADN en funció de la temperatura.
6. La temperatura de fusió d’una molècula bacteriana d’ADN és aquella a la qual…
   a. la desnaturalització és del 50%.
7. Com es pot resumir la relació entre la temperatura de fusió (Tm) de les molècules de gran grandària i el contingut en parells GC?
   d. A major percentatge de parells GC, major Tm.
8. Quin nom rep el procés pel qual les dues cadenes d’una molècula d’ADN separades mitjançant desnaturalització tèrmica tornen a reassociar-se, fins a formar la doble hèlix original?
   a. Renaturalització.
9. La cinètica de la renaturalització està condicionada per…
   b. La concentració de les cadenes en solució.
10. Quins factors influeixen en la hibridació?
    b. La força iònica de la solució, la presència d’agents desnaturalitzants i el percentatge de bases no complementàries o mismatch.
11. L’augment de l’absorbància que es produeix amb la desnaturalització es coneix com a…
    b. Efecte hipercròmic.
12. Quin nom rep la capacitat que té una sonda per a discriminar la seqüència diana amb la qual s’ha d’hibridar?
    b. Especificitat.
13. Quin nom reben les sondes més utilitzades, perquè són fàcils d’obtenir en grans quantitats i per la seva versatilitat?
    a. Sondes d’ADN.
14. Respecte les sondes d’ADN recombinant, assenyala l’opció correcta.
    c. Presenten alta especificitat i sensibilitat.
15. Respecte el marcatge de les sondes…
    d. Utilitza haptens com la biotina per a la detecció de l’híbrid.
16. Quin nom reben els elements químics amb capacitat d’emetre radiacions?
    d. Isòtops radioactius.
17. Quin nom rep el mètode de marcatge de sondes d’ADN bicatenari o monocatenari de petita i mitjana grandària?
    d. Marcatge terminal.
18. En què consisteix la purificació d’una sonda?
    b. En l’eliminació dels nucleòtids lliures marcats.
19. A la corba de l’esquerra la lletra B correspon a:
    b. Les seqüències moderadament repetides.
20. La imatge representa:
    c. Una corba de renaturalització procariota.
21. La temperatura de fusió d’un híbrid…
    d. Disminueix amb la presència d’híbrids imperfectes.
22. La velocitat de renaturalització respecte a la complexitat de la molècula és:
    b. Inversament proporcional.
23. Una de les característiques de les sondes PNA és:
    d. Hibriden més ràpidament i de forma estable.
24. Les ribosondes…
    b. Estan formades per ARN.
25. Quin és el mètode de marcatge que utilitza el Fragment Klenow?
    a. Encegament a l’atzar.

Les Sondes Moleculars: Tipus i Característiques

L'elecció de la sonda depèn de l'especificitat i la sensibilitat, a més del tipus de mostra, la tècnica i el marcatge utilitzat.

Criteris d'Elecció de Sondes

• Especificitat: Capacitat de discriminar la seqüència diana amb la qual hibridarà.
• Sensibilitat: Probabilitat de detectar la quantitat mínima d'híbrid sonda-diana.

Sondes d'ADN

Avantatges de les Sondes d'ADN

• Es poden obtenir en gran quantitat.
• Són ben estudiades i compreses.

Tipus de Sondes d'ADN

1. Síntesi química:
   • Monocatenàries, mida reduïda (~200 nucleòtids).
   • Avantatges: No necessiten desnaturalització, millor penetració en el teixit.
   • Desavantatges: Baixa sensibilitat i facilitat d'hibridació inespecífica.
2. ADN recombinant:
   • Bicatenari, mida gran.
   • Avantatges: Alta sensibilitat i especificitat.
   • Desavantatges: Requereix desnaturalització.
3. PCR:
   • Bicatenari, mida intermèdia.
   • Desavantatge: Necessita desnaturalització.

Sondes d'ARN (Ribosondes)

• S'utilitzen menys que les d'ADN.
• Sempre monocatenàries, per la qual cosa no necessiten desnaturalització.
• Avantatges: L'híbrid ARN/ADN és més estable.
• Desavantatges: Són sensibles a la contaminació per ARNasa.

Tipus de Sondes d'ARN

1. Síntesi química: Seqüència de ribonucleòtids (similar a les sondes d'ADN químic).
2. Transcripció: Es transcriu el fragment d'interès.

Sondes Químiques Sintètiques d'Àcid Nucleic

Solubilitat reduïda, només s'obtenen per síntesi química.

Tipus de Sondes Sintètiques

1. Sonda PNA (Pèptids Nucleics):
   • No tenen càrrega elèctrica, amb enllaços amida.
   • Avantatges: Gran estabilitat, hibridació ràpida i específica, alta afinitat.