Mètodes i tècniques per a la quantificació i identificació de proteïnes

Complex blau fosc

Complex blau fosc. Avantatges: molt sensible i específic. Inconvenients: necessari calibrar amb una proteïna coneguda; no segueix estrictament la llei de Beer; reacció interferida per sucres i lípids; el color varia segons la proteïna.

Mètode Bradford

Colorimètric. El colorant brillant de Coomassie s’uneix a les proteïnes i canvia de color de vermell a blau.

• Avantatges: ràpid, sensible; no interfereixen ni sucres ni cations metàl·lics.
• Inconvenients: interferència de detergents; cal calibrar amb una proteïna coneguda; el color varia segons la proteïna.

Mètode BCA (àcid bicinconínic)

Colorimètric. Les proteïnes redueixen ions Cu2+ a Cu+ en condicions alcalines. El Cu+ forma un complex amb el BCA de color porpra.

• Avantatges: sensible; no interfereixen detergents ni solucions amortidores en molts casos.
• Inconvenients: la coloració no és estable indefinidament (canvia amb el temps); és necessari calibrar amb una proteïna coneguda; sucres rics en reducció poden interferir; el color varia segons la proteïna.

Absorbància a 280 nm (UV)

Absorbància forta deguda als residus de triptòfan i tirosina.

• Avantatges: ràpid i sensible.
• Inconvenients: els àcids nucleics també absorbeixen a 280 nm; es requereix un sistema relativament pur.

Separació i quantificació d'aminoàcids

Composició d'aminoàcids: s’hidrolitza la mostra de proteïna per alliberar els aminoàcids. Els aminoàcids se separen i quantifiquen amb tècniques cromatogràfiques (d'intercanvi catiónic, cromatografia líquida de fase inversa). Es realitza derivatització precolumna o postcolumna. Detectores: espectroscòpics (UV-Vis, fluorescència) i espectrometria de masses (MS). Pretractament: extracció de la mostra.

Derivatització: pot fer-se abans o després de la separació per millorar la separació o la detecció.

Separació i identificació de proteïnes

Mètodes cromatogràfics

Mètodes cromatogràfics: intercanvi iònic, exclusió per mida, cromatografia líquida de fase inversa.

Electroforesi

Electroforesi: migració de molècules carregades dins d'una dissolució causada per un camp elèctric. El procediment es basa en el fet que les proteïnes tenen càrrega diferent a un pH determinat, en funció del nombre i tipus de grups ionitzables presents a la molècula.

Qualitat nutricional de les proteïnes

Determinada per la composició en aminoàcids i la digestibilitat.

Coeficient d'eficiència proteica: mesura l’increment del creixement d’una espècie animal d’experimentació en funció dels grams de la proteïna problema introduïda en la seva dieta.

Càlcul proteic amb digestibilitat corregida

Contingut de l'aminoàcid indispensable limitant-se a la proteïna problema, respecte al contingut d’aquest aminoàcid en la proteïna de referència, multiplicat per la digestibilitat veritable de la proteïna problema. El coeficient s’estableix en relació amb el nitrogen ingerit i el nitrogen fecal excretat.