PCR i Genètica Forense: Guia Completa de Tècniques i Aplicacions

Definició de la PCR

La Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR) és una tècnica de biologia molecular que permet amplificar ADN in vitro, obtenint múltiples còpies a partir d’una mostra mínima.

Tipus de PCR

• PCR Estàndard: Amplificació d’un únic fragment d’ADN.
• RT-PCR (PCR amb Transcripció Inversa): Amplificació de fragments d’ARN, que requereix un pas previ de transcripció inversa.
• qPCR (PCR Quantitativa en Temps Real): Mesura en temps real la quantitat d’ADN amplificat.

Avantatges de la PCR

• Estalvi de temps i material.
• Gran sensibilitat, fins i tot amb poca mostra.
• Automatització de tot el procés.

Aplicacions de la PCR

• Diagnòstic mèdic.
• Estudis genètics.
• Paleontologia.
• Medicina forense.

Principis de la Reacció en Cadena de la Polimerasa

Procés Enzimàtic

El procés de la PCR és catalitzat per una ADN-polimerasa i es basa en el mecanisme de replicació de l’ADN.

Principis Clau de la Reacció

• Increment exponencial de còpies d’ADN en cada cicle.
• Necessitat de dissenyar encebadors específics.

Encebadors (Primers)

Els encebadors, o primers, són oligonucleòtids que delimiten el fragment d’ADN a amplificar.

Requisits dels Encebadors

• Longitud: Entre 18 i 30 nucleòtids. Una longitud inferior pot comprometre l'especificitat, mentre que una superior pot reduir el rendiment.
• Contingut en G+C: Idealment entre el 40% i el 60%.
• Temperatura de Fusió (Tm): Entre 52-65ºC. És crucial evitar seqüències complementàries entre els encebadors per prevenir la formació de dímers.

ADN-Polimerases Termoestables

Origen

Aquestes polimerases s'obtenen d’arqueobacteris termòfils, com ara Thermus aquaticus (d'on prové la coneguda Taq polimerasa).

Característiques

• Resistents a temperatures elevades (70-75ºC).
• Poden suportar temps prolongats a 95ºC.

Tipus d'ADN-Polimerases

• Sense activitat exonucleasa 5’ → 3’: No tenen capacitat de correcció d’errors.
• Amb activitat exonucleasa 3’ → 5’ i 5’ → 3’: Posseeixen activitat correctora, augmentant la fidelitat.
• Amb activitat transcriptasa inversa: Permeten sintetitzar ADNc a partir d’ARN.

El Cicle Bàsic de la PCR

El cicle bàsic de la PCR consta de tres fases principals:

• Desnaturalització: Separació de les cadenes d’ADN motlle a 94-95ºC durant 15-30 segons.
• Hibridació (Annealing): Unió dels encebadors amb l’ADN motlle a una temperatura de 50-65ºC durant 30-60 segons.
• Extensió: Allargament dels encebadors per l’ADN-polimerasa a 72ºC. La Taq polimerasa, per exemple, sintetitza aproximadament 60 nucleòtids per segon.

Temps d'Extensió Recomanat

• Fragments < 1 kb: 30-45 segons.
• Fragments 1-3 kb: Fins a 2 minuts.

Productes d'Amplificació

• Amplicons: Són els productes d'amplificació desitjats.
• Productes no desitjats: Són productes intermedis que es poden formar durant els primers cicles de la reacció.

Progressió dels Productes

En cada cicle de PCR, els amplicons (productes desitjats) augmenten exponencialment (2^n), mentre que els productes no desitjats ho fan de manera aritmètica.

PCR Estàndard: Components i Procés

La PCR estàndard es caracteritza per l'amplificació d’un fragment únic d’ADN mitjançant un parell d’encebadors.

Components de la Mescla de Reacció

• Tampó: Manté el pH òptim per a l'activitat enzimàtica.
• Clorur de Magnesi (MgCl₂): És un cofactor essencial per a l’activitat de l’ADN-polimerasa.
• dNTPs (desoxiribonucleòtids trifosfat): Són els substrats necessaris per a la síntesi de noves cadenes d’ADN.
• Encebadors: Es requereix una concentració equimolar per a cada encebador (forward i reverse).
• ADN-Polimerasa: La seva elecció depèn del tipus de PCR i de la fidelitat requerida.
• ADN Motlle: És la font de l’ADN d’interès que es vol amplificar.
• Additius: Poden incloure potenciadors per optimitzar la reacció de PCR.
• Control Positiu: S'utilitza per verificar que l’amplificació funciona correctament.
• Control Negatiu: Assegura que no hi ha contaminació en els reactius o en el procés.

Preparació i Execució

Master Mix

La Master Mix és una mescla que conté tots els components de la reacció, excepte l’ADN motlle, per assegurar la consistència i reduir errors.

Termociclador i Cicles

El procés es realitza en un termociclador, que segueix un programa amb les següents etapes:

• Desnaturalització inicial: 94-95ºC (generalment un cicle llarg).
• Cicles d'amplificació: 25-35 cicles de desnaturalització, hibridació i extensió.
• Extensió final: 72ºC durant 5-10 minuts.
• Manteniment: A 4ºC per conservar els productes.

Anàlisi dels Productes de PCR

Els productes d'amplificació s'analitzen habitualment mitjançant electroforesi en gel d’agarosa per visualitzar els fragments d'ADN.

Modalitats Avançades de PCR

Principals Modalitats

• Hot Start PCR: Inicia la reacció a una temperatura elevada per minimitzar la formació de productes inespecífics.
• PCR de Grans Fragments: Permet l'amplificació de fragments de fins a 35 kb, utilitzant ADN-polimerases amb activitat correctora i temps d’extensió prolongats.
• PCR d’Alta Fidelitat: Minimitza els errors de replicació mitjançant l'ús de polimerases amb activitat correctora i un ajust precís del pH i la concentració de Mg²⁺.

PCR en Temps Real (qPCR)

Característiques Clau

La qPCR permet monitoritzar l’amplificació de l’ADN en temps real gràcies a la detecció de fluorescència.

Avantatges de la qPCR

• Ràpid i precís.
• Detecció d'ADN en temps real.
• Minimitza la contaminació post-PCR.

La intensitat de la fluorescència és directament proporcional a la quantitat d’ADN sintetitzat.

Aplicacions de la qPCR

• Quantificació de la quantitat inicial d’ADN: Permet determinar la càrrega gènica o viral.
• Anàlisi de corbes de fusió: Permeten detectar mutacions o polimorfismes mitjançant la variació de la intensitat de fluorescència durant la desnaturalització del producte de PCR.

Genètica Forense i Anàlisi d'ADN

Definició

La Genètica Forense és la disciplina que aplica l'anàlisi d’ADN per a la identificació de persones en estudis forenses.

Tipus d'ADN en Genètica Forense

• ADN de seqüència única: Representa aproximadament el 50% del genoma.
• ADN repetitiu en tàndem:
  • ADN Satèl·lit: Seqüències llargues amb milers de repeticions.
  • Minisatèl·lit (VNTR): Seqüències de 6-25 nucleòtids repetits, formant fragments de 100 a 20 kb.
  • Microsatèl·lit (STR): Seqüències de 2-6 nucleòtids repetits, formant fragments menors de 500 nucleòtids.
• ADN Dispers:
  • SINE (Short Interspersed Nuclear Elements): Seqüències curtes disperses (com les seqüències Alu).
  • LINE (Long Interspersed Nuclear Elements): Seqüències llargues i disperses.

Polimorfismes Genètics

Polimorfismes de Longitud

• VNTR (Variable Number Tandem Repeat): Corresponen als minisatèl·lits polimòrfics.
• STR (Short Tandem Repeat): Corresponen als microsatèl·lits amb seqüències repetides curtes.

Polimorfismes de Seqüència

• SNP (Single Nucleotide Polymorphism): Variació d’un únic nucleòtid en una posició específica del genoma.

Empremta Genètica

L'empremta genètica és el conjunt d’al·lels de diversos marcadors genètics (com VNTR, STR i SNP) que caracteritzen un individu.

Metodologies d'Anàlisi en Genètica Forense

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): Anàlisi de polimorfismes de longitud de fragments de restricció.
• Anàlisi d’STR amb PCR: Especialment útil amb quantitats mínimes d’ADN, ja que la PCR permet amplificar-los.
• Anàlisi d’SNP: Representa un avanç significatiu cap a l’anàlisi de polimorfismes de seqüència.
• ADN Mitocondrial: És més resistent a la degradació, sent útil per a mostres antigues o degradades. Presenta herència materna.
• Cromosoma Y: S'utilitza per a estudis de llinatges paterns i és especialment rellevant en casos de delictes sexuals.