Tècniques Immunològiques: Guia Completa de Mètodes de Laboratori

Precipitació

Tub d'Oudin

Tub amb anticòs (Ac). S'afegeix antigen (Ag) i s'observa la línia de precipitació. A major concentració d'antigen, més baixa és la línia.

En Placa o Mancini

Placa amb agar i una concentració homogènia d'anticòs (Ac). Es fa un pou i s'hi afegeix antigen (Ag), formant un diàmetre de precipitació. A major concentració d'antigen, més gran és el diàmetre.

Radial Doble

Placa de Petri amb agar. S'afegeix un anticòs (Ac) i dos antígens (Ag) per observar la línia de precipitació. També es pot afegir una barreja d'anticossos i antígens de diferent concentració, i finalment la mostra del pacient per comparar.

Immunoelectroforesi

Placa prima d'agar. Es fa un pou per al sèrum i un altre per a la mostra del pacient, i es realitza una electroforesi. Després, s'afegeix anticòs (Ac) al pou i s'espera la difusió.

Contraimmunoelectroforesi

Similar a la doble immunodifusió. Es fan dos pous, un per a l'antigen (Ag) i un altre per a l'anticòs (Ac), i es provoca una electroforesi perquè es creuin. (L'anticòs migra cap al pol positiu i l'antigen cap al negatiu).

En Rocket

Placa amb agar que ja incorpora l'anticòs (Ac). Es fan diferents pous amb diferents antígens (Ag). Es realitza una electroforesi perquè l'antigen es desplaci, formant una 'coet' de precipitació.

Aglutinació

Aglutinació Directa

Utilitza partícules naturals (p. ex., eritròcits) per buscar antígens (Ag) propis.

Aglutinació Indirecta o Passiva

Utilitza partícules artificials (p. ex., de làtex) per recobriment amb antígens (Ag) o anticossos (Ac).

Detecció d'Anticossos

1. Pas 1 (Sensibilització): Les partícules de làtex es recobreixen amb antígens solubles.
2. Pas 2 (Aglutinació): S'afegeix la mostra amb anticossos (Ac) a les partícules sensibilitzades. Si hi ha aglutinació, significa que tenim anticossos.

Detecció d'Antígens (Indirecta Inversa)

Si es busquen antígens (Ag), s'utilitza la variant indirecta inversa (les partícules estan recobertes amb anticossos).

Inhibició de l'Aglutinació

Mètode per buscar antígens (Ag) solubles.

Resultat: No Aglutinació

Si la mostra conté antígens (Ag), aquests s'uneixen als anticossos (Ac) afegits, formant complexos. Quan s'afegeixen partícules sensibilitzades (recobertes amb Ag), els anticossos ja estan units i no poden unir-se a les partícules, per tant, no hi ha aglutinació.

Resultat: Aglutinació

Si la mostra no conté antígens (Ag), els anticossos afegits no formen complexos i s'uneixen lliurement a les partícules sensibilitzades, provocant aglutinació.

Coombs

Coombs Directe

Detecta anticossos units directament a la superfície dels eritròcits. S'afegeixen eritròcits del pacient (potencialment marcats amb hemolisines) i antiglobulina humana. Si els eritròcits del pacient tenen anticossos units, es produirà aglutinació.

Coombs Indirecte

Detecta anticossos lliures en el sèrum del pacient.

1. Pas 1: S'incuba el sèrum del pacient amb eritròcits de laboratori. Si hi ha anticossos (Ac) en el sèrum, s'uniran als eritròcits.
2. Pas 2: Es barreja la suspensió amb antiglobulina humana. Si hi ha anticossos units als eritròcits, es produirà aglutinació.

Immunonefelometria

Mètode basat en la dispersió d'un feix de llum. Es barreja el sèrum amb anticossos (Ac) i els complexos antigen-anticòs formats desvien el feix de llum, la qual cosa es mesura.

Fixació del Complement

Mètode per buscar anticossos (Ac) o antígens (Ag) solubles.

Lectura Positiva

Indica la presència d'anticossos o antígens en la mostra. S'afegeix sèrum del pacient (amb anticossos) i antigen de laboratori per formar complexos antigen-anticòs. Després s'afegeix proteïna del complement (que s'uneix als complexos). Finalment, s'afegeixen eritròcits sensibilitzats. Si el complement s'ha fixat als complexos, NO hi haurà lisi dels eritròcits.

Lectura Negativa

Si no hi ha anticossos en la mostra, el complement queda lliure i lisi els eritròcits sensibilitzats. Hi haurà LISI dels eritròcits.

Tècniques Immunoenzimàtiques

EMIT

Mètode per detectar haptens (molècules petites). Es barreja la mostra del pacient (amb o sense haptens) amb un hapten unit a un enzim i anticossos (Ac) que reconeixen l'hapten. Pot passar que els anticossos s'uneixin a l'hapten del pacient o a l'hapten unit a l'enzim. Si es formen molts complexos anticòs-hapten del pacient, queden més haptens units a l'enzim lliures, resultant en més color.

ELISA

ELISA Competitiu amb Antigen Marcat

La placa està recoberta amb anticossos (Ac). S'afegeix la mostra del pacient (amb antigen) i antigen marcat. Els antígens de la mostra i els marcats competeixen pels llocs d'unió dels anticossos. Es renta i s'afegeix substrat. A major concentració d'antigen en la mostra, menys antigen marcat s'unirà, resultant en menys color.

ELISA Competitiu amb Anticòs Marcat

La mostra del pacient (amb antigen soluble) es barreja amb anticossos (Ac) marcats amb enzims, formant complexos. Aquesta barreja es posa en pous que contenen antigen de laboratori fixat. Si els anticossos ja s'han unit a l'antigen de la mostra, no es podran unir a l'antigen de la placa. Es renta i s'afegeix substrat. A major concentració d'antigen en la mostra, menys anticòs marcat s'unirà a la placa, resultant en menys color.

ELISA No Competitiu (Sandwich)

La placa està recoberta amb anticossos (Ac) de captura. S'afegeix l'antigen (Ag) del pacient, que s'uneix als anticossos de la placa. Després s'afegeixen anticossos secundaris marcats amb enzim que s'uneixen a l'antigen capturat (si no s'uneixen, és perquè no hi ha antigen). Es renta i s'afegeix substrat. A major concentració d'antigen en la mostra, més color es generarà.

ELISA No Competitiu per Mesurar Anticossos

Un suport (placa) està fixat amb antigen de laboratori. S'afegeix la mostra del pacient (amb anticossos), que formen complexos amb l'antigen fixat. Després s'afegeix un segon anticòs anti-Fc marcat amb enzim. Es renta. A major concentració d'anticossos en la mostra, més color es generarà.

Tècniques Radioimmunològiques

Mètode Competitiu

La placa està recoberta amb anticossos (Ac) fixats. S'afegeix la mostra del pacient (amb antigen) i antigen radioactiu. Els antígens de la mostra i els radioactius competeixen pels llocs d'unió dels anticossos. A major concentració d'antigen en la mostra, menys radioactivitat s'unirà a la placa.

Mètode No Competitiu

La placa està recoberta amb antigen de laboratori fixat. S'afegeix la mostra del pacient (amb anticossos). Després s'afegeix un segon anticòs marcat amb un isòtop radioactiu que s'uneix als anticossos del pacient. A major concentració d'anticossos en la mostra, més radioactivitat s'unirà a la placa.

Immunofluorescència (IFA)

Mètode Directe

S'aplica un anticòs marcat amb un fluorocrom directament sobre una mostra de teixit del pacient. Si hi ha antígens (Ag) presents, es formaran complexos. Es renta i s'observa al microscopi de fluorescència.

Mètode Indirecte

Un portaobjectes està recobert amb antigen de laboratori fixat. S'afegeix la mostra del pacient (amb anticossos). Després s'afegeix un segon anticòs marcat amb un fluorocrom que s'uneix a la fracció constant (Fc) dels anticossos del pacient. A major presència d'antigen o anticòs, més fluorescència s'observarà.