Tècniques de Purificació Bioquímica: Salting-Out i Cromatografia Iònica

Precipitació amb Sals (Salting-Out)

La precipitació amb sals es basa en la separació de proteïnes en presència d’elevades concentracions salines. Les altes concentracions salines generen medis de gran força iònica, la qual cosa incrementa les interaccions hidrofòbiques entre proteïnes, disminuint dràsticament la seva solubilitat en el medi aquós i provocant la precipitació.

Fases del Procés de Precipitació

1. Precipitació de proteïnes: S’afegeix al lisat una solució salina concentrada i s’agita amb el vòrtex. A continuació, es centrifuga la mescla. Les proteïnes sedimenten al fons com un pellet, i en el sobrenedant queden els àcids nucleics, les sals i els components hidrosolubles del lisat.
2. Precipitació de l'ADN: El sobrenedant es transfereix a un tub net, s’afegeix un volum igual d’isopropanol i es mescla. L’ADN precipita i sedimenta mitjançant centrifugació.
3. Rentat i resuspensió de l'ADN: S’elimina el sobrenedant, es renta l’ADN amb etanol i es resuspèn en aigua destil·lada.

Cromatografia d’Intercanvi Iònic

Aquesta tècnica es basa en la unió electrostàtica reversible d’ions en solució a grups funcionals carregats que estan units covalentment a una fase estacionària.

Tipus d'Intercanviadors

Quan els grups funcionals de la fase estacionària tenen càrrega neta positiva, es parla d’intercanviadors aniònics, ja que s’uniran reversiblement els ions negatius que es troben en la solució. Quan els grups funcionals de la fase estacionària tenen càrrega neta negativa, parlem d’intercanviadors catiònics, ja que s’uniran a ions positius en la solució.

Per a la purificació, es fan servir matrius de sílice o cel·lulosa empaquetades en columnes de polipropilè. A la matriu se li uneix covalentment un intercanviador aniònic, ja que els àcids nucleics són polianions amb una forta càrrega negativa a causa dels grups fosfat. Els dos grups funcionals més utilitzats són el metilaminoetanol (MAE) i el dietilaminoetil (DEAE).

Procediment de Purificació

1. La columna de cromatografia es carrega amb una dilució del lisat en un tampó de baixa salinitat i pH neutre. Els àcids nucleics (càrrega negativa) s’uneixen als grups funcionals de l’intercanviador.
2. Després, es renta la columna amb un tampó de salinitat creixent. Així s’eliminen contaminants de càrrega dèbil.
3. L’ADN s’elueix de la columna amb un tampó de màxima salinitat i pH elevat. Es finalitza amb un procés de resuspensió normal.

Aquest mètode permet purificar de manera individualitzada diferents tipus d’àcids nucleics.