Perros

3. Que objeto tiene la activación de las placas.

Eliminar el exceso de solvente ya que por lo general se agrega una sustancia adhesiva a la mezcla para mejorar la adhesión de las partículas sólidas entre si y con el vidrio. Se deja entonces ia placa en reposo hasta que la placa se asienta y se adhiere intensamente a su superficie y en algunos casos se calienta en horno durante varias horas y así dejarías listas para la aplicación de la muestra.

4. Mencione las características a tomar en cuenta en el adsorbente, soluto y solvente.

Para el adsorbente deben de ser compuestos inorgánicos, deben tener características muy polares, tener alta afinidad con solutos muy polares. Para el solvente debe tener baja polaridad y no debe reaccionar con el adsorbente. Para el soluto, entre más polar sea el soluto (compuesto) se adsorberá con más fuerza.

La absorción se favorece con pesos moleculares altos.

5. Qué efecto (en caso de que lo hubiera) podría presentar el Rf si la placa recubierta se dejara
al aire en un día húmedo.

Se altera, ya que se ha demostrado la absorción de agua a partir de la humedad del aire y se produce en pocos minutos, en este caso la superficie volvería a ser un soporte para un liquido.

1.- Defina qué es la cromatografía.

La cromatografía es una técnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados a través de una fase fija o estacionaria por una fase móvil gaseosa o líquida.

Mediante la cromatografía es posible separar, identificar y posteriormente cuantificar ros componentes de mezclas que de otra manera solo pueden separarse con grandes dificultades, o incluso no separarse. Es una técnica utilizada tanto con fines analíticos como preparativos.

2.- Describa los problemas con los que se enfrentó para empacar correctamente la columna.

Realmente no hubo contratiempos mayores, salvo a que se había introducido una cantidad excesiva de sílika gel, situación que se corrigió de inmediato y sin mayor problema tras la indicación de la profesora.

3.- Proponga un sistema de separación que permita estar seguro de que cada fracción está constituida por un solo componente.

Puede realizarse una cromatografía de afinidad, que es la más selectiva. Ésta emplea  interacciones específicas entre una clase de moléculas de soluto y una segunda moléculaque está unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo unido a una proteína determinada. Si se pasa a través de la columna una mezcla que contiene un millar de proteínas, solo la proteína que reacciona con el anticuerpo se fija en la columna. Después de lavar los demás solutos de la columna, se libera la proteína deseada modificando el pH o la fuerza iónica.

4 - Explique el fundamento de la separación de los componentes de una mezcla por 'cromatografía de reparto.

La cromatografía de reparto utiliza una fase estacionaria líquida que forma una fina película sobre la superficie de un soporte sólido. El soluto está en equilibrio entre el líquido estacionario y la fase móvil. La cromatografía de reparto puede clasificarse en dos tipos: de fase normal, y de fase reversa, donde las principales diferencias radican en las distintas polaridades de sus fases estacionarías y móviles.

En la cromatografía de fase reversa la fase estacionaría es apolar, y la fase móvil polar. La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria (apolar) y la fase móvil (polar). Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y selectividad se controlan fundamentalmente con la composición de la fase móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza y elución óptima, se ensayan mezclas de metano!, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

En la cromatografía de fase normal, la fase estacionaria es polar y la móvil apolar. La retención también tiene lugar en esa especie de capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluir.

5 ¿Cómo selecciona los solventes en un sistema de elución por gradiente?

Los solventes se seleccionan de acuerdo a la polaridad de los componentes de la mezcla que se van a separar, de tal manera que si se quiere separar un componente de la mezcla que es apelar se elige un solvente que tenga afinidad con éste, es decir, que también sea apolar como el hexano o heptano. De igual manera, si el componente a separar es polar se elige un solvente polar para que se logre la elución; o bien, si se van a separar distintos componentes en la mezcla que tienen distintas polaridades se emplean solventes que tengan alta polaridad, polaridad media y no polares, para lograr la elución de los diversos componentes y de esta manera lograr su separación.

1.- ¿Qué influencia tendría sobre el cromatograma obtenido en esta práctica si?:

a) En lugar de tener una columna C-18 se utilizara una C-8

El tiempo de retención del ácido gálico habría sido mayor debido a una mayor afinidad por la columna C-8 que la mostrada por la C-18, ya que la primera muestra una menor hidrofobicidad que la segunda.

b) Se disminuyera el flujo de la fase móvil

También tendría un tiempo de retención mayor debido a que el paso del ácido gálico se da por su interacción con la fase móvil que es una solución polar y al disminuir el flujo de esta fase también disminuiría el flujo de la muestra a analizar.

 c) En lugar de hacer una solución por gradiente se hace una solución isocrática, con la última condición propuesta

 Si se hiciera con una solución isocrática únicamente serían eluidas las sustancias afines a la composición de la fase móvil empleada, el resto, es decir las que no son afines, serían retenidas por la fase estacionaria.

2.- ¿Qué sucedería si por descuido, no se filtra el extracto de materia colorante y se inyecta en el cromatógrafo?

Un error como ese puede ser muy perjudicial para los componentes del sistema de HPLC. Las partículas pueden ocasionar daños costosos a la bomba de HPLC, el guarda columnas y en general causar desgaste del sistema de HPLC. En el mejor de los casos los resultados arrojados por la cromatografía serían erróneos debido a la presencia de agentes contaminantes. Es por ello que se recomienda la filtración y desgasificación de los solventes HPLC antes de su empleo.

3.- ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durante una corrida que presentó fuertes variaciones en la presión de tas bombas? ¿Qué puede ocasionar este comportamiento?

No sería confiable un cromatograma obtenido bajo estas condiciones debido a que la presión ayuda a mantener un flujo constante en, el cromatógrafo y una variación en la presión ocasionaría también variaciones en el flojo de la fase móvil y de la muestra a eluir por lo que se verían alterados los tiempos de retención de los componentes de la muestra a separar.

4.- ¿Qué otros sistemas de detección son de uso frecuente en los cromatógrafos de alta resolución?

• Detectores de Absorbencia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna cromatográfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las/intensidades de los dos haces se usan detectores fotoeléctricos contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representación en función del tiempo del logaritmo del cociente de las dos señales transducidas. También se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia.

Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente.

Detectores de índice de refracción: Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía de gases. Se añade que son fiables, no dependen del caudal, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles corrió la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizaran la elución con gradiente.

Detector de dispersión de luz: El eluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla gracias a un flujo de nitrógeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de conducción a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase móvil y se originan partículas de analito. Estas partículas pasan a través de un láser y por un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser más sensible que el detector de índice de refracción.

Detectores   Electroquímicos:   Actualmente   hay   varios   tipos   de detectores electroquímicos, que se basan en cuatro métodos: amperometría, voltamperometría, coulombimetría, conductimetda.

Detectores por espectrometría de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas. De forma general se pueden  obtener tanto  cromatogramas  a  tiempo  real  como  reconstruidos  por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.