Biotecnología e Ingeniería Genética: Fundamentos, Técnicas y Aplicaciones

De la biotecnología a la ingeniería genética

• Biotecnología: es la utilización de organismos vivos o de sus componentes en la obtención de productos útiles para las personas. Algunos productos son el pan y el vino, que se obtienen por fermentación microbiana.
• Ingeniería genética: es el conjunto de métodos y técnicas que permiten el acceso y la manipulación del ADN.
• Transgénico: son organismos que han sido modificados por ingeniería genética.
• ADN recombinante: es una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos.

Aplicaciones de la ingeniería genética

• Medicina: para diagnósticos de enfermedades, medicamentos, estudios forenses y terapia génica.
• Agricultura: para conseguir plantas resistentes a determinados herbicidas, mejorar el contenido nutritivo de algunos alimentos o como fábrica de medicamentos.
• Ganadería: la mejora del rendimiento de explotaciones ganaderas. También se obtienen animales transgénicos para utilizar órganos en los xenotrasplantes u obtener sustancias de interés farmacéutico.
• Medio ambiente: mediante la biorremediación se pueden combatir los vertidos de petróleo.

Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética

• La genómica: rama de la genética que estudia el genoma completo de un organismo, tanto estructural como funcionalmente.
• La proteómica: estudia, estructural y funcionalmente, todas las proteínas codificadas por un genoma concreto.
• La farmacogenética: estudio del mecanismo de acción de los fármacos en el organismo y de la genética, es decir, del estudio de la transmisión de los caracteres hereditarios.

Obtención de fragmentos de ADN

El primer paso es la obtención del gen mediante la tecnología del ADN recombinante, la formación de un ADN complementario o su obtención sintética.

Tecnología del ADN recombinante

Permite cortar la molécula de ADN por lugares concretos para, posteriormente, unir los fragmentos obtenidos con ADN procedente de una fuente diferente, con el fin de obtener una molécula de ADN recombinante o transgénico. Se desarrolla a partir de las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción, que reconocen en el ADN una pequeña secuencia de bases determinada, denominada sitio de restricción.

La mayoría de los sitios de restricción son simétricos: la secuencia de nucleótidos es la misma en ambas cadenas cuando se leen en dirección 5'→3'. Estas secuencias se denominan palindrómicas.

Las enzimas de restricción dividen los esqueletos de azúcar-fosfato en ambas cadenas de ADN. Algunas dejan extremos lisos y otras escalonados. En estos últimos, los fragmentos de restricción tienen un extremo monocatenario denominado extremo cohesivo o pegajoso, porque pueden unirse mediante puentes de hidrógeno con la secuencia de bases complementarias.

Las moléculas de ADN de distinto origen cortadas con la misma enzima de restricción producen fragmentos cuyos extremos pueden unirse por enlaces de hidrógeno. Estas uniones temporales pueden hacerse permanentes mediante la ADN ligasa, que cataliza la formación de enlaces covalentes que cierran los esqueletos de azúcar-fosfato. La unión de ADN procedente de dos orígenes distintos produce una molécula de ADN recombinante.

Formación de un ADN complementario por hibridación

En condiciones fisiológicas normales, la molécula de ADN es muy estable, pero se pueden separar las dos hebras alterando el pH por encima de 13 o calentando a temperaturas en torno a 100 °C. Se produce entonces la desnaturalización del ADN. Este proceso es reversible: se consigue manteniendo las hebras complementarias a una temperatura de 65-55 °C durante un tiempo prolongado, formándose una nueva hélice con total funcionalidad. A este proceso se le denomina renaturalización o hibridación del ADN.

De la misma forma que las dos hebras de un ADN pueden renaturalizarse, también se puede conseguir que dos hebras de distinta procedencia lo hagan. Cuanto más relacionadas estén los ADN, mayor porcentaje de renaturalización se producirá.

Las técnicas de hibridación pueden servir para detectar secuencias complementarias, localizar genes relacionados en distintas poblaciones o diagnosticar enfermedades genéticas que se producen por alteraciones en la secuencia de ADN.

Síntesis de un ADNc utilizando como molde ARNm

El objetivo del ADN recombinante es obtener múltiples copias de un gen de interés. Cuando se trata de genes de organismos eucariotas, la utilización de enzimas de restricción conllevaría la obtención de muchos fragmentos de ADN formados por intrones y exones. La clonación tiene lugar en procariotas.

Gracias a la enzima transcriptasa inversa es posible sintetizar un ADN de cadena sencilla utilizando como molde un ARNm madurado. Este ADNc sirve como molde para la síntesis de otro ADNc de doble cadena que carece de intrones y puede ser traducido por las bacterias.

Clonación del ADN

La clonación es un proceso extendido en la naturaleza que consiste en la producción de individuos genéticamente iguales mediante reproducción asexual. Referido al ADN, consiste en producir múltiples copias de un gen específico en el interior de un organismo hospedador.

Se utilizan organismos procariotas, aunque también es posible con eucariotas como la levadura. El organismo que se utiliza como hospedador debe reunir estas características:

• Ser de crecimiento rápido para obtener varias generaciones en poco tiempo.
• Desarrollarse en un medio de cultivo económico, para que el proceso no encarezca.
• No ser patógeno, para que no produzca infecciones.
• Favorecer la entrada del transgén e incorporar a su genoma el ADN de interés.
• Ser un organismo del que se tenga amplio conocimiento y además sea fácilmente manipulable.

Vectores de clonación

Para incorporar el gen que se quiere clonar en el hospedador se utilizan los vectores de clonación, que son moléculas de ADN capaces de transportar ADN extraño y replicarse dentro del organismo hospedador. Todos los vectores, además de poseer su propio origen de replicación, deben portar genes marcadores que sirvan para su rápida y fácil identificación. Pueden ser de varios tipos: los que confieren al hospedador resistencia a determinados antibióticos, los que codifican una proteína fácilmente detectable o genes de bioluminiscencia.

Los vectores más utilizados son:

• Plásmidos: son pequeñas moléculas de ADN bicatenario y circular que se localizan en las bacterias. No forman parte del cromosoma bacteriano, tienen capacidad para replicarse independientemente ya que poseen su propio origen de replicación. Además, confieren resistencia a algunos antibióticos como la ampicilina, o al hospedador alguna característica que permite identificar con facilidad el gen que portan.
• Virus bacteriófagos: son virus que infectan bacterias. Durante la transducción, algunos genes de la bacteria usada pueden incorporarse a su genoma. Cuando el fago infecta otra bacteria, puede transferirle los genes de la primera. Los más empleados son los lambda, que transportan mayor cantidad de ADN que un plásmido.
• Cósmidos: son vectores híbridos entre el fago y un plásmido. Su ADN puede replicarse en la célula como un plásmido o empaquetarse como un fago. Poseen la porción cos del bacteriófago, que incluye los genes necesarios para que el material genético pueda empaquetarse. Tienen origen de replicación plasmídico, les confieren resistencia a determinados antibióticos y un número de sitios de restricción donde pueden insertarse el ADN foráneo.

Clonación de un gen humano en un plásmido bacteriano

Se inserta uno o más genes marcadores en el plásmido utilizado como vector.

1. Se aísla el ADN humano y el plásmido, y se cortan con la misma enzima de restricción.
2. Se mezclan los fragmentos de ADN humano con los plásmidos cortados.
3. Se mezclan los plásmidos con bacterias.
4. Se siembran las bacterias sobre una placa de Petri.

Almacenamiento de los genes clonados

El almacenamiento de los genes clonados forma genotecas de ADN, que contienen miles de clones que portan el gen de interés. En una genoteca genómica completa, los segmentos de ADN extraño abarcan todo el genoma de un individuo. Se utilizan ácidos nucleicos para diferenciar unos clones de otros.

Las genotecas de ADN pueden ser de plásmidos, fagos y cósmidos.

Identificación de clones mediante sondas

Una genoteca de ADN puede estar formada por cientos de miles de ADN recombinantes, la mayoría de los cuales no lleva el gen de interés. Para localizar el ADN recombinante que lo porta se utilizan sondas de ADN. Las sondas son pequeños oligonucleótidos de cadena sencilla, de no más de 20 nucleótidos, que se hibridan con cualquier ADN recombinante que tenga la secuencia de bases complementaria. Pueden obtenerse sintéticamente. Por ejemplo:

5'-TAGAGGCTAACGTATAGC-3' → 3'-TCCGATTGCATA-5'

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La clonación del ADN es el mejor método para obtener grandes cantidades de un determinado gen, pero no sirve cuando la muestra de ADN es muy escasa. En estos casos se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permite amplificar una muestra muy pequeña de ADN.

La PCR es un proceso que se realiza automáticamente y en poco tiempo, y permite conseguir hasta 100.000 millones de copias. Cada ciclo dura aproximadamente 5 minutos, y con 20 ciclos se puede obtener la cantidad de ADN útil.

Aplicaciones de la PCR: fue desarrollada por el bioquímico estadounidense Kary Mullis, y tuvo gran impacto en la investigación biológica. El ADN que se amplifica puede proceder de:

• Fragmentos de ADN antiguos.
• ADN obtenido en la escena de un crimen.
• ADN de células embrionarias.
• ADN de genes virales, como el VIH.

Secuenciación del ADN

Uno de los métodos más utilizados para la secuenciación del ADN es el método didesoxi de Sanger. Utiliza didesoxirribonucleótidos, que son nucleótidos modificados que han perdido el grupo -OH situado en el carbono 3'. Su pérdida implica que, una vez que la ADN polimerasa agrega un nucleótido concreto, no puede agregar ningún otro, ya que necesita el grupo -OH para formar el enlace fosfodiéster que une dos nucleótidos consecutivos.

Genómica y proteómica

La genómica es el conocimiento del genoma completo y de las interacciones que tienen los genes que lo componen. Sus principales líneas de trabajo son:

• Identificación de genes codificadores de proteínas, y de genes que codifican proteínas todavía desconocidas, denominados genes huérfanos o candidatos.
• Estudio de los genes que interactúan entre sí: uno de los objetivos más importantes de la genómica es comprender la forma en que los genes funcionan de manera conjunta para producir y mantener un organismo en funcionamiento.
• Comparación entre genomas de distintas especies: ha permitido establecer relaciones evolutivas. Cuanta mayor similitud en la secuencia, mayor parentesco evolutivo tendrán.

El futuro de la genómica es la proteómica. El término proteoma se denomina al conjunto de proteínas de un genoma, de una célula o de un tejido. La proteómica es la disciplina que realiza un estudio sistemático del conjunto completo de proteínas codificadas por el genoma de un organismo. Es muy importante conocer el sitio y el momento en que se producen, así como la manera en que interactúan entre ellas, lo que permitirá comprender mejor no solo el funcionamiento de las células, sino el del organismo completo.

Ingeniería genética y medicina

Obtención de productos farmacéuticos

Muchas enfermedades están provocadas por la carencia de una proteína. La insulina, el interferón, la hormona del crecimiento o el factor VIII de la coagulación se producen mediante ingeniería genética.

Medicina forense

Los seres humanos somos un 99,9 % genéticamente idénticos y diferimos solo en un 0,1 %. Estas pequeñas diferencias se encuentran en regiones cromosómicas concretas y es posible utilizarlas como marcadores genéticos. La identificación de estas regiones permite utilizar estas diferencias como una huella genética individual para la identificación de restos humanos y en pruebas de paternidad.

Diagnóstico de enfermedades

Permite detectar en una persona o en el feto los genes responsables de enfermedades genéticas como la anemia falciforme o la hemofilia. También puede detectar la presencia, en muestras de sangre o tejido, de determinados virus como el que provoca el SIDA.

Terapia génica

Es una técnica terapéutica mediante la cual se inserta un gen funcional en las células de un paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva función. La enfermedad tiene que estar provocada por un gen recesivo, quedando descartadas aquellas determinadas por múltiples genes o bien las producidas por alteraciones cromosómicas. Puede llevarse a cabo en células somáticas y en germinales. Las alteraciones genéticas introducidas en las células somáticas no se transmiten a la descendencia; en estos casos, la terapia génica en células germinales conlleva problemas éticos complejos.

La terapia génica en células somáticas puede ser:

• Ex vivo: se extraen células del paciente, se corrige el defecto genético en el laboratorio y después se reintroducen en el interior del organismo.
• In vivo: se realiza directamente en el paciente mediante un vector, por ejemplo mediante una inyección intravenosa.
• In situ: se realiza directamente en las células del paciente, introduciendo los genes funcionales en el órgano afectado.

La terapia génica se utilizó por primera vez con los llamados niños burbuja (síndrome de inmunodeficiencia combinada severa), que se debe a la deficiencia de la enzima adenosina desaminasa (ADA).

Ingeniería genética, agricultura y medio ambiente

Gracias a la técnica del ADN recombinante se han conseguido plantas transgénicas con distintas características:

• Resistencia a herbicidas.
• Mejora del producto.
• Plantas farmacéuticas.

Las aplicaciones de la ingeniería genética en el medio ambiente se realizan de dos formas:

• Biorremediación: son bacterias capaces de degradar materia orgánica. Pueden modificarse para que sean capaces de hacerlo con mayor rendimiento y en condiciones ambientales diversas.
• Bioadsorción: las bacterias genéticamente modificadas son capaces de adsorber ciertos metales pesados que contaminan el suelo.

Ingeniería genética y ganadería

Para el estudio de enfermedades humanas se pueden obtener animales transgénicos, que son aquellos que portan en su dotación genética un gen extraño.

Clonación terapéutica y reproductiva en animales

La clonación terapéutica consiste en la creación de embriones por clonación para utilizarlos como materia prima en distintas terapias, mientras que la clonación reproductiva pretende conseguir animales genéticamente iguales a otro, a partir de una célula adulta.

La clonación reproductiva mediante transferencia nuclear es el método más utilizado, y consiste en:

1. Se obtiene una célula somática del individuo que se quiere clonar.
2. Se extrae un óvulo de una hembra donante y se elimina su núcleo.
3. Se reemplaza este núcleo por el de la célula somática.
4. Se desarrolla la célula creada hasta formar un embrión.
5. Se implanta en el útero de una hembra de la misma especie, donde culmina su desarrollo.

La descendencia es genéticamente igual al donante de la célula somática.

Proyecto Genoma Humano

Objetivos del proyecto

El objetivo principal era secuenciar el genoma humano para poder elaborar mapas que permitieran saber cuántos genes son codificadores de proteínas. Los objetivos concretos eran:

1. Situar genes y marcadores moleculares en mapas genéticos, es decir, el ordenamiento relativo de genes y de otro tipo de secuencias identificables en el ADN.
2. Caracterizar y localizar físicamente fragmentos de ADN clonados, para crear mapas físicos de cada cromosoma.
3. Secuenciar los pequeños fragmentos para luego ensamblarlos y obtener la secuencia genómica completa, generando así un mapa completo de secuencias de cada cromosoma.