Características de las ADN polimerasas termoestables y componentes de una mezcla estándar de PCR

Sobre las ADN polimerasas termoestables:

a) Características principales de una ADN polimerasa para PCR:

• Temperatura óptima de polimerización entre 70 y 75ºC, lo que permite realizar la hibridación de los cebadores al ADN molde en condiciones de alta rigurosidad (temperatura elevada), aumentando la especificidad de la PCR.
• Estable durante tiempos prolongados a 95ºC, por lo que mantiene su actividad después de las fases de desnaturalización.

b) Diferencia entre ADN polimerasa con y sin actividad correctora:

• Las ADN polimerasas con actividad correctora tienen actividad exonucleasa 3’→5’, por lo que pueden eliminar nucleótidos incorporados erróneamente durante la polimerización y sustituirlos por los correctos.
• Las ADN polimerasas sin actividad correctora no tienen actividad exonucleasa 3’→5’, por lo que no pueden corregir los errores producidos durante la polimerización.

c) Temperatura óptima de polimerización y actividad de una ADN polimerasa:

• Una ADN polimerasa con temperatura óptima de polimerización de 42 ºC y actividad tras dos horas a 100 ºC no puede usarse en PCR, ya que los cebadores hibridarían inespecíficamente a 42ºC.

Componentes de una mezcla estándar de PCR:

• Tampón de reacción: aporta la concentración salina y establece el pH óptimo para la ADN polimerasa.
• MgCl2: el Mg2+ es el cofactor imprescindible para que la ADN polimerasa tenga actividad.
• dNTPs: Han de estar libres en solución para que la ADN polimerasa los utilice en la síntesis de amplicones.
• Cebadores: al hibridar con sus respectivas secuencias diana forman cortas regiones en doble hélice a las que se une la ADN polimerasa para elongarlos. Además, delimitan el fragmento que se va a amplificar.
• ADN polimerasa termoestable: es la responsable de la síntesis de amplicones, extendiendo los cebadores mediante incorporación de los dNPTs que hay en solución y copiando el ADN molde.
• Agua grado PCR: completa el volumen de reacción para que todos los componentes se encuentren a la concentración adecuada.