Características de las ADN polimerasas termoestables y componentes de una mezcla estándar de PCR

Resumen

El texto explica las características que debe tener una ADN polimerasa para usarse en PCR, como su temperatura óptima de polimerización y su estabilidad a 95 ºC, y diferencia las polimerasas con y sin actividad correctora. También describe los componentes de una mezcla estándar de PCR, como el tampón, el MgCl2, los dNTPs, los cebadores, la polimerasa y el agua grado PCR, y su función en la amplificación.

Puntos clave

Una ADN polimerasa para PCR debe tener una temperatura óptima de polimerización entre 70 y 75 ºC.
Debe ser estable durante tiempos prolongados a 95 ºC para resistir la desnaturalización.
Las polimerasas con actividad correctora poseen actividad exonucleasa 3’→5’ y pueden eliminar nucleótidos incorporados erróneamente.
El Mg2+ aportado por el MgCl2 es el cofactor imprescindible para la actividad de la ADN polimerasa.
Los cebadores delimitan el fragmento que se va a amplificar y permiten la unión de la polimerasa para elongarlos.
El agua grado PCR completa el volumen de reacción para que los componentes estén a la concentración adecuada.

Ponte a prueba

Sobre las ADN polimerasas termoestables:

a) Características principales de una ADN polimerasa para PCR:

Temperatura óptima de polimerización entre 70 y 75ºC, lo que permite realizar la hibridación de los cebadores al ADN molde en condiciones de alta rigurosidad (temperatura elevada), aumentando la especificidad de la PCR.
Estable durante tiempos prolongados a 95ºC, por lo que mantiene su actividad después de las fases de desnaturalización.

b) Diferencia entre ADN polimerasa con y sin actividad correctora:

Las ADN polimerasas con actividad correctora tienen actividad exonucleasa 3’→5’, por lo que pueden eliminar nucleótidos incorporados erróneamente durante la polimerización y sustituirlos por los correctos.
Las ADN polimerasas sin actividad correctora no tienen actividad exonucleasa 3’→5’, por lo que no pueden corregir los errores producidos durante la polimerización.

c) Temperatura óptima de polimerización y actividad de una ADN polimerasa:

Una ADN polimerasa con temperatura óptima de polimerización de 42 ºC y actividad tras dos horas a 100 ºC no puede usarse en PCR, ya que los cebadores hibridarían inespecíficamente a 42ºC.

Componentes de una mezcla estándar de PCR:

Tampón de reacción: aporta la concentración salina y establece el pH óptimo para la ADN polimerasa.
MgCl2: el Mg2+ es el cofactor imprescindible para que la ADN polimerasa tenga actividad.
dNTPs: Han de estar libres en solución para que la ADN polimerasa los utilice en la síntesis de amplicones.
Cebadores: al hibridar con sus respectivas secuencias diana forman cortas regiones en doble hélice a las que se une la ADN polimerasa para elongarlos. Además, delimitan el fragmento que se va a amplificar.
ADN polimerasa termoestable: es la responsable de la síntesis de amplicones, extendiendo los cebadores mediante incorporación de los dNPTs que hay en solución y copiando el ADN molde.
Agua grado PCR: completa el volumen de reacción para que todos los componentes se encuentren a la concentración adecuada.

Preguntas frecuentes

¿Por qué la ADN polimerasa para PCR debe ser termoestable?

Porque debe mantener su actividad tras las fases de desnaturalización a 95 ºC, que se repiten en cada ciclo de la PCR. Además, su temperatura óptima de polimerización elevada permite una hibridación de los cebadores en condiciones de alta rigurosidad.

¿Qué función tiene el Mg2+ en la mezcla de PCR?

El Mg2+, aportado por el MgCl2, es el cofactor imprescindible para que la ADN polimerasa tenga actividad.