Electroforesis SDS-PAGE: Protocolo y Reactivos

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Resumen

Este documento describe los reactivos y el procedimiento de la práctica de electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Explica cómo limpiar y montar los cristales, preparar el gel separador al 12% y el gel apilador al 4%, preparar y calentar las muestras, aplicar 200 voltios y teñir el gel con azul Coomassie. El estudiante aprenderá los pasos de la práctica en el laboratorio.

Puntos clave

  • El gel separador es al 12% de acrilamida/bisacrilamida, con un volumen final de 30 ml, y llega a 2,5 cm del borde superior de los cristales.
  • Se añaden 0,2 ml de isopropanol sobre el gel separador para definir su borde y evitar ondulaciones. Después se elimina antes de añadir el gel apilador.
  • El gel apilador es al 4% de acrilamida/bisacrilamida, con un volumen final de 10 ml, y se vierte tras la polimerización del gel separador.
  • Cada muestra se mezcla con 10 µl de tampón de carga y 2 µl de 2-β-mercaptoetanol, se calienta 5 minutos en agua hirviendo y se pasa a hielo.
  • La electroforesis se hace con un tampón de electrodo de Tris-base 0,025 M (pH 8,3), glicina 0,192 M y SDS 0,1%, a 200 voltios.
  • La tinción se hace con una solución de metanol 40%, ácido acético 10% y Coomassie Blue R-250 0,125%.

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Reactivos para la práctica 5: Electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida en presencia de SDS

  • Acrilamida 40%
  • Metilen-bis-acrilamida 2%
  • SDS
  • TEMED
  • Persulfato amónico
  • Tris
  • Glicina
  • HCl
  • Metanol
  • Ácido acético
  • Azul Coomassie
  • 2-β-mercaptoetanol
  • Azul de bromofenol
  • Hielo

Procedimiento

  1. Limpieza de los cristales

    Limpiar los cristales con agua abundante y después con etanol y acetona para eliminar restos de grasa.

  2. Montaje de los cristales

    Montar los cristales en el sistema de electroforesis.

  3. Preparación del gel separador

    Se preparan 30 ml de volumen final de un gel al 12% de acrilamida/bisacrilamida.
  4. Verter la mezcla entre los dos vidrios hasta una altura de 2,5 cm desde el borde superior, dejando un pequeño volumen en el vaso de precipitado para comprobar la polimerización.
  5. Añadir con cuidado 0,2 ml de isopropanol para definir perfectamente el borde del gel y evitar ondulaciones. Una vez polimerizado, se elimina todo el isopropanol antes de añadir el gel apilador.

  6. Preparación del gel apilador

    Se preparan 10 ml de volumen final de un gel al 4% de acrilamida/bisacrilamida.
  7. Cuando el gel separador haya polimerizado completamente, verter el gel concentrador hasta rellenar todo el espacio entre los vidrios e inmediatamente colocar el peine que definirá los pocillos para las muestras.
  8. Una vez polimerizado, quitar el peine en vertical y con cuidado.
  9. Rellenar los pocillos con tampón Tris pH=8,3 y, con una pipeta, eliminar el tampón.

  10. Preparación de las muestras

    Se preparan las muestras mezclándolas con el tampón de carga de la siguiente manera:
    • 10 µl de muestra
    • 10 µl de tampón de carga (Tris/HCl 0,125 M pH 6,8; SDS 4%; Glicerol 20%; azul de bromofenol 0,1%)
    • 2 µl de 2-β-mercaptoetanol
  11. Calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos.
  12. Pasar a hielo.

  13. Electroforesis

    Colocar el portador de geles en el aparato de electroforesis, eliminar todo el tampón y rellenar la cubeta con 300 ml del tampón de electrodo compuesto por:
    • Tris-base 0,025 M, pH 8,3
    • Glicina 0,192 M
    • SDS 0,1%
  14. Aplicar el campo eléctrico a 200 voltios. Una vez transcurrida la electroforesis, desconectar la fuente de alimentación.

  15. Tinción

    Retirar los cristales y ponerlos a teñir manteniéndolos en una solución compuesta por:
    • Metanol 40%
    • Ácido acético 10%
    • Coomassie Blue R-250 0,125%

Preguntas frecuentes

¿Qué porcentaje de acrilamida tiene el gel separador?

El gel separador es al 12% de acrilamida/bisacrilamida, con un volumen final de 30 ml. El gel apilador es al 4%, con un volumen final de 10 ml.

¿A qué voltaje se aplica el campo eléctrico?

Se aplica a 200 voltios. Cuando termina la electroforesis, se desconecta la fuente de alimentación.

¿Cómo se tiñen los cristales después de la electroforesis?

Se retiran los cristales y se tiñen en una solución de metanol 40%, ácido acético 10% y Coomassie Blue R-250 0,125%.

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Test

1. ¿Qué porcentaje de acrilamida tiene el gel separador?
2. ¿A qué voltaje se aplica el campo eléctrico en la electroforesis?
3. ¿Qué se hace con las muestras después de calentarlas 5 minutos en agua hirviendo?
4. ¿Para qué se añade isopropanol sobre el gel separador?
5. ¿Qué solución se usa para teñir los cristales?

Preguntas generadas con IA a partir del documento: comprueba las respuestas con el texto.