Enterobacterias: Características, Aislamiento e Identificación en Microbiología

Enterobacterias

Enterobacterias son bacilos no esporulados, móviles por flagelos peritricos, Gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos, que fermentan la glucosa con producción de gas, no fermentan la lactosa y reducen los nitratos a nitritos. Son citocromo oxidasa negativos.

Medios de enriquecimiento y cultivo

Para el aislamiento de Salmonella se emplean medios de enriquecimiento como el caldo Rappaport-Vassiliadis (RVS), el caldo selenito cistina y el caldo tetrationato (T).

Procedimiento de detección de Salmonella

Preenriquecimiento: 25 g de muestra en 225 ml de caldo (1/10) a 37 ºC durante 16 a 20 horas.

• Enriquecimiento selectivo: 0,1 ml sobre 10 ml de RVS a 42 ºC durante 18 a 24 horas.
• 10 ml de caldo sobre 100 ml de selenito cistina a 37 ºC durante 18 a 24 horas.

Aislamiento diferencial: se siembra en agar Hektoen entérico y en agar verde brillante (BGA). Las colonias de Salmonella aparecen en BGA como colonias rosadas con halo rojo, y en Hektoen como colonias verdeazuladas con o sin centro negro, tras incubación a 37 ºC durante 24 a 48 horas.

Confirmación

Se seleccionan al menos 2 colonias sospechosas y se inoculan en 4 tubos de TSI (agar hierro tres azúcares) y 4 tubos de rosca TSI. Con asa de cultivo, se inocula en TSI por picadura y en superficie, sin flamear ni recargar, e incubar a 37 ºC durante 24 horas en TSI y 48 horas en LIA (agar lisina hierro).

Interpretación

• TSI: pico rojo y fondo amarillo, con o sin producción de H₂S (ennegrecimiento).
• LIA: pico rojo y fondo púrpura con o sin producción de H₂S.

Cultivo en medios selectivos y diferenciales

El agar Hektoen es un medio selectivo y diferencial. Las sales biliares lo hacen selectivo, y la lactosa, sacarosa y salicina permiten la diferenciación. Salmonella no fermenta la lactosa ni la sacarosa. El citrato férrico de amonio y el tiosulfato de sodio permiten detectar la producción de sulfuro de hidrógeno (H₂S), que genera un precipitado negro.

Recuento de microorganismos aerobios mesófilos

Para la dilución decimal se pesan 10 g de muestra en 90 ml de diluyente (1/10). Se utiliza asa de siembra, vidrio, estufa, pipetas y placa de Petri, con medio PCA (Plate Count Agar).

• Procedimiento: 1 ml de caldo más 15 ml de PCA, tiempo de exposición y movimiento. Incubar a 31 ºC durante 72 horas. Se cuentan entre 30 y 300 colonias y se expresa el resultado en UFC/g o UFC/ml.
• Recuento de esporas: 15 ml de PCA por placa, secar y usar 0,1 ml por duplicado. Incubar a 31 ºC durante 72 horas.
• Recuento total psicrótrofo: temperatura entre 4 ºC y 20 ºC. Son Gram positivos (Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus).

Medios: solución de Ringer 1/4, agar King (KF agar), agar GSP. Se siembra por duplicado 0,1 ml de cada dilución decimal con solución de Ringer sobre placas de agar King y/o agar GSP, incubando a 17 ºC durante 5 días. Se cuenta el número de colonias por gramo o mililitro.

Escherichia coli: recuento y confirmación

Medios: caldo BGBL (bilis verde brillante lactosa), agar levadura, agua peptonada, reactivo de Kovacs.

• Se utiliza un tubo con campana invertida de Durham. Se inoculan 0,1 ml en caldo BGBL y se incuba a 44,5 ºC durante 24 y 48 horas.
• Lectura: tubos positivos con producción de gas.
• Confirmación: 0,1 ml de cultivo sobre agar levadura a 44,5 ºC; colonias de color verde brillante con brillo metálico.
• Indol: 1,2 colonias en agua peptonada a 44,5 ºC durante 24 horas; tras añadir 0,5 ml de reactivo de Kovacs, aparece un anillo rojo-violáceo que indica positividad.

Recuento de Enterobacteriaceae

Medios: caldo TSB, caldo EE Mossel, agar VRBG (violeta rojo bilis glucosa), caldo CO, agar KIA, agar PCA.

• Preenriquecimiento: 1/10 en TSB durante 2 horas; siembra en EE Mossel a 37 ºC durante 24 horas.
• Identificación: tubos con crecimiento en placa.
• Confirmación: 2 colonias sobre PCA a 37 ºC durante 18 a 24 horas.

Pruebas bioquímicas

• Citocromo oxidasa (CO): 3 gotas de solución de violeta de metilo oscuro; resultado negativo si no hay coloración.
• Prueba de Kliger (KIA): 7 ml de medio, inclinado sólido, sembrar por picadura a 37 ºC durante 24 horas. Glucosa: fondo amarillo; lactosa: superficie amarilla.

Coliformes fecales

Tinción de Gram negativa, bacilos entéricos. Se realiza en caldo BGBL con CDH (3 tubos por 3 diluciones) y se siembra en agar VRBA por duplicado: 1 ml + 4 ml de agar rojo violeta bilis glucosa.