Espectrofotometría: Ley de Lambert - Beer y sus aplicaciones

La espectrofotometría

es la capacidad que tienen las moléculas de absorber o emitir selectivamente ondas electromagnéticas de una λ específica. La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión matemática para esta ley es: A = ε l c

Limitaciones de la ley de Lambert-Beer

La linealidad de la ley de Lambert-Beer está limitada por factores químicos e instrumentales:

• Variaciones en la absortividad a altas concentraciones
• Dispersión de la luz debido a la presencia de material particulado en la muestra.
• Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.
• Cambios en el equilibrio químico dependientes de la concentración.

La longitud de onda de trabajo corresponde, a la longitud de onda en la cual la absorbancia del analito es máxima, y recibe la denominación de Lambda máximo (λmax).

Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro electromagnético (380 a 800 nm). En el caso de sustancias no coloreadas (200 a 380nm).

La curva de calibración

Es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de concentraciones conocidas (estándar), con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda de trabajo

A = m x+ b A: absorbancia m: pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra y el espesor b de la cubeta. X: valor de concentración del analito

b: intercepto de la recta

El espectrofotómetro

Es un equipo que nos permite hacer mediciones a una longitud de onda fija.

Componentes básicos de un espectrofotómetro

Fuentes de luz

• Lámparas de deuterio e hidrógeno
• Lámparas de filamento de tungsteno

Selectores de longitud de onda.

Es la parte más importante del equipo. Son dispositivos que filtran el espectro producido por la fuente

• Filtros de absorción
• Filtros de interferencia
• Monocromadores

Recipientes para la muestra

Las celdas o cubetas que contienen la muestra deben fabricarse de un material que no interfiera con la radiación que estamos utilizando.

Proteínas y absorción

Una aplicación bastante antigua de la espectrofotometría es la determinación de proteínas en solución, se utilizará el método de Bradford para la cuantificación de proteínas totales.Se fundamenta en la formación de un complejo entre el azul de coomassie G-250 y las proteínas Este colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina. las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes reductores y la posibilidad de medir proteínas de alto peso molecular. La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con detergentes