Espectrofotometría: Ley de Lambert-Beer, curva de calibración y aplicaciones

Resumen

El texto explica la espectrofotometría, la ley de Lambert-Beer y sus limitaciones, así como la construcción de una curva de calibración. Describe los componentes básicos de un espectrofotómetro, como las fuentes de luz, los selectores de longitud de onda y las cubetas. Incluye también la aplicación del método de Bradford para cuantificar proteínas totales.

Puntos clave

La Ley de Lambert-Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas absorbentes presentes en la solución, expresada como A = ε l c.
La linealidad de la ley se ve limitada por variaciones en la absortividad a altas concentraciones, dispersión de la luz, fluorescencia o fosforescencia y cambios en el equilibrio químico.
La longitud de onda de trabajo es la λmax, donde la absorbancia del analito es máxima.
Para sustancias coloreadas se mide en el visible (380-800 nm); para sustancias no coloreadas, en 200-380 nm.
La curva de calibración relaciona la absorbancia de al menos cinco soluciones estándar con su concentración mediante la ecuación A = m x + b.
El método de Bradford cuantifica proteínas mediante la formación de un complejo con el azul de Coomassie G-250, aunque es incompatible con detergentes.

Ponte a prueba

La espectrofotometría

es la capacidad que tienen las moléculas de absorber o emitir selectivamente ondas electromagnéticas de una λ específica. La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión matemática para esta ley es: A = ε l c

Limitaciones de la ley de Lambert-Beer

La linealidad de la ley de Lambert-Beer está limitada por factores químicos e instrumentales:

Variaciones en la absortividad a altas concentraciones
Dispersión de la luz debido a la presencia de material particulado en la muestra.
Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.
Cambios en el equilibrio químico dependientes de la concentración.

La longitud de onda de trabajo corresponde, a la longitud de onda en la cual la absorbancia del analito es máxima, y recibe la denominación de Lambda máximo (λmax).

Si se trata de sustancias coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro electromagnético (380 a 800 nm). En el caso de sustancias no coloreadas (200 a 380nm).

La curva de calibración

Es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de concentraciones conocidas (estándar), con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda de trabajo

A = m x+ b A: absorbancia m: pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de la muestra y el espesor b de la cubeta. X: valor de concentración del analito

b: intercepto de la recta

El espectrofotómetro

Es un equipo que nos permite hacer mediciones a una longitud de onda fija.

Componentes básicos de un espectrofotómetro

Fuentes de luz

Lámparas de deuterio e hidrógeno
Lámparas de filamento de tungsteno

Selectores de longitud de onda.

Es la parte más importante del equipo. Son dispositivos que filtran el espectro producido por la fuente

Filtros de absorción
Filtros de interferencia
Monocromadores

Recipientes para la muestra

Las celdas o cubetas que contienen la muestra deben fabricarse de un material que no interfiera con la radiación que estamos utilizando.

Proteínas y absorción

Una aplicación bastante antigua de la espectrofotometría es la determinación de proteínas en solución, se utilizará el método de Bradford para la cuantificación de proteínas totales.Se fundamenta en la formación de un complejo entre el azul de coomassie G-250 y las proteínas Este colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina. las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes reductores y la posibilidad de medir proteínas de alto peso molecular. La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con detergentes

Preguntas frecuentes

¿Qué establece la Ley de Lambert-Beer?

Establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente presentes en la solución por la que pasa el haz electromagnético. Su expresión matemática es A = ε l c.

¿Qué es la λmax?

Es la longitud de onda de trabajo en la que la absorbancia del analito es máxima. Se usa para realizar las mediciones.

¿Qué limitación tiene el método de Bradford?

Su principal limitación es la incompatibilidad con detergentes. En cambio, es compatible con agentes reductores y permite medir proteínas de alto peso molecular.