Fundamentos de Biología Molecular: Vectores de Expresión, Genotecas y Replicación del ADN Eucariota

Vectores de Expresión: Fundamentos y Aplicaciones Biotecnológicas

Cuando se requiere insertar un nuevo gen en un determinado sistema celular con interés comercial o experimental, es fundamental la construcción correcta de un vector de expresión. Se define como una construcción genética que permite la introducción de un gen exógeno determinado en una célula diana, la cual debe ser capaz de expresarlo eficientemente.

Elementos Clave de un Vector de Expresión

Sus elementos básicos son:

• Origen de replicación autónomo.
• Promotor del gen de interés (pueden ser constitutivos, histoespecíficos o inducibles).
• Una región de clonaje múltiple (RCM) donde se insertará el gen de interés.
• Gen de selección.
• Secuencias génicas reguladoras.

El Sitio de Clonaje Múltiple (RCM)

El sitio de clonaje múltiple del vector es una región del ADN provista de varias dianas únicas para diferentes enzimas de restricción.

Aplicaciones y Generación de Organismos Transgénicos

Gracias a estos vectores, podemos obtener organismos transgénicos. Somos capaces de introducir genes de interés en células que, en condiciones naturales, no los tendrían. Esto permite generar productos nuevos con mayor facilidad para su purificación y comercialización, optimizar los procesos de producción industrial o generar microorganismos con nuevas características de interés que aporten beneficios.

Genotecas: Almacenamiento y Clonación de Material Genético

Genoteca Genómica

Se producen cuando el genoma completo de un organismo se corta en millares de fragmentos mediante enzimas de restricción que efectúan cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada. Se realiza una digestión parcial del genoma, generando así una colección de genes superpuestos con una longitud idónea para ser clonados. Los fragmentos grandes o demasiado pequeños se eliminan mediante electroforesis o centrifugación. Tras ligar el vector y el fragmento de ADN, este se introduce en una célula huésped.

Genotecas de ADNc (ADN Complementario)

Contienen copias de ADN complementario (ADNc) del ARNm presente en un determinado tejido. El clon obtenido contiene solamente exones de un gen y, por lo tanto, es una representación directa de la secuencia codificante de un gen, sin los intrones ni otras secuencias promotoras.

Genotecas de Expresión

Son similares a las genotecas de ADNc, pero tienen, además del exón, señales de transcripción y traducción necesarias para la regulación de la expresión del gen clonado. Se usan para la producción de proteínas transgénicas. Además, se pueden añadir etiquetas que faciliten la identificación de la proteína una vez sintetizada.

Mecanismos de Replicación del ADN en Eucariotas

ADN Polimerasas y Procesividad

La ADN Polimerasa delta (δ) está asociada a la proteína PCNA (Antígeno Nuclear de Células en Proliferación), que se encuentra en grandes cantidades en las células en proliferación. Su estructura tridimensional es muy parecida a la estructura beta (β) de la procariota y su función es similar, ya que forma una abrazadera circular que potencia la procesividad de la polimerasa.

La ADN Polimerasa épsilon (ε) estaría más relacionada con la reparación y la eliminación de cebadores.

Complejos Auxiliares de la Replicación

Intervienen dos complejos clave:

• RPA (Proteína A de Replicación): Equivale a las SSB (Proteínas de Unión a Cadena Sencilla) procariotas.
• RFC (Factor de Carga de la Abrazadera): Es el cargador de la abrazadera para la PCNA.

Control del Ciclo Celular

El sistema de control del ciclo es un dispositivo bioquímico basado en las Ciclinas y las Quinasas Dependientes de Ciclinas (CDK) que inducen y coordinan los procesos básicos del ciclo, como la duplicación del ADN y la división celular.

Inicio de la Replicación: Orígenes (ORI)

Los orígenes de replicación (ORI) se encuentran sobre cada lazo de cromatina y se caracterizan por poseer una secuencia común denominada ARS (Secuencia de Replicación Autónoma), formada por dos secuencias GAGGC.

El segundo componente del complejo pre-replicativo (pre-R) es la proteína Cdc6p, que se sintetiza en G1 e inserta los orígenes de replicación al último componente. Al inicio de la fase S, se induce la apertura de los orígenes de replicación, activando a las moléculas responsables de la síntesis de ADN e induciendo la separación del complejo pre-R. Separando este complejo, se inicia la síntesis. Los cromosomas a partir de este momento se denominan post-replicativos.

Terminación y el Problema del Acortamiento Telomérico

Los organismos eucariotas poseen cromosomas lineales, lo que presenta el problema de su acortamiento durante la replicación. Esto se debe a que, al eliminar el cebador de los fragmentos de Okazaki del extremo 5' de la cadena retardada del telómero del nuevo cromosoma lineal, se produce un hueco que no puede ser rellenado por acción de la ADN polimerasa, puesto que solo funciona en dirección 5' a 3' y necesita un extremo 3'-OH libre.