Fundamentos de Citometría de Flujo y Crossmatch en Trasplantes

Citometría de Flujo

La citometría de flujo consiste en el estudio de células en movimiento. Permite diferenciar y evaluar simultáneamente distintas características celulares en partículas en suspensión con diámetros comprendidos entre 0,2 y 150 µm.

Ventajas y Desventajas

• Ventajas:
  • Procesamiento de un alto número de células en un período muy corto de tiempo (5.000 a 20.000 eventos/segundo).
  • Alta sensibilidad.
  • Capacidad multiparamétrica.
  • Identificación precisa de subpoblaciones celulares.
• Desventajas:
  • Alto costo instrumental de los citómetros.
  • Exige alta experiencia por parte del operador.
  • El espécimen siempre debe encontrarse en suspensión.
  • Aporta poca información sobre la morfología celular (solo permite estimar tamaño y complejidad interna).

Fundamento

Permite medir y registrar en forma simultánea las características fenotípicas de partículas individuales en suspensión a partir de la dispersión de la luz y la emisión de fluorescencia.

Propiedades medidas:

• Tamaño y complejidad relativa: determinados por la dispersión y proyección del haz de luz.
• Intensidad de fluorescencia relativa: proporcionada por la excitación del fluorocromo acoplado a la célula o partícula.

Sistemas del Citómetro de Flujo

1. Sistema de fluidos: Encargado de alinear y transportar las partículas en suspensión hacia el haz de luz. Permite el enfoque hidrodinámico (modalidad en que las células pasan una a una en fila india) y define el punto de interrogación (lugar exacto donde el láser impacta sobre la célula).
2. Sistema óptico: Compuesto por láseres, lentes y prismas para dirigir el haz. Ilumina las células y conduce las señales luminosas resultantes hacia los detectores.
3. Sistema electro-informático: Integrado por detectores, fotomultiplicadores y un ordenador. Emplea sensores lumínicos como fotodiodos y tubos fotomultiplicadores (PMT), cuya finalidad es convertir los fotones en electrones y estos en una corriente eléctrica cuantificable.

Parámetros de dispersión de luz:

• FSC (Forward Scatter): Detecta la luz dispersada hacia adelante; provee información proporcional al tamaño de la partícula.
• SSC (Side Scatter): Detecta la luz dispersada en un ángulo de 90° respecto a la línea de propagación del láser; aporta información sobre la complejidad interna y la granularidad celular.

Crossmatch por Citometría de Flujo (FCXM)

La prueba cruzada o crossmatch por citometría de flujo (FCXM) es una técnica de alta resolución aplicada en la evaluación inmunológica de compatibilidad pre y postrasplante.

Ventajas del FCXM

• No requiere la separación física de linfocitos T y B.
• No es un método operador-dependiente.
• Presenta una sensibilidad aproximadamente 100 veces mayor que la técnica de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
• Detecta exclusivamente anticuerpos anti-HLA (a diferencia de CDC, que puede detectar también anticuerpos no HLA).
• Ampliamente utilizado en protocolos de alotrasplante de progenitores hematopoyéticos y órganos sólidos.

Interpretación de Resultados

• Ratio: Intensidad media de fluorescencia de la muestra dividida por la del control negativo.
• MESF (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome): Expresión de datos estandarizada, de gran utilidad para comparar resultados longitudinales en un mismo paciente o realizar comparaciones interlaboratorio.
• Criterio cualitativo: Interpretación del resultado final categorizado como positivo, negativo o no determinado.
• En cada corrida de FCXM se incluye obligatoriamente un suero comercial AB (-) como control de calidad.

Características Principales

• Técnica de fluorescencia indirecta: Su objetivo no es cuantificar la población de linfocitos T o B, sino identificar la presencia de anticuerpos anti-HLA de tipo IgG unidos a la superficie celular, revelando la existencia de anticuerpos preformados.
• Independiente del complemento: No requiere la cascada lítica del complemento, ya que el ensayo no evalúa lisis celular directa.
• Detección de anticuerpos anti-HLA de bajo título: Complementada con la metodología Luminex (LUM), permite diagnosticar de forma precoz los anticuerpos específicos contra el donante (DSA) preformados o surgidos de novo postrasplante.
• Guía terapéutica: Orienta la necesidad de ajustes farmacológicos (inmunosupresión) de acuerdo con la positividad de la prueba en la monitorización postrasplante renal.

Objetivos del Crossmatch por Citometría de Flujo

• Evaluar el riesgo inmunológico previo al trasplante: si al paciente se le detectan anticuerpos mediante Luminex, se solicita un crossmatch confirmatorio.
• Detectar anticipadamente anticuerpos anti-HLA preformados en el suero del receptor dirigidos contra antígenos HLA del potencial donante, así como monitorizar a linfocitos T y B de forma simultánea.
• Identificar anticuerpos de bajo título (~3.000 MFI).
• Diferenciar y caracterizar subpoblaciones de linfocitos T (CD3+) y linfocitos B (CD19+) mediante anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos específicos.

Metodología y Preparación de Muestra

• Muestras requeridas: Donante (sangre total anticoagulada con heparina, 30-40 mL) y receptor (5 mL de suero).
• Separación de linfocitos: Se realiza por gradiente de densidad con Histopaque y posterior tratamiento con la enzima pronasa.
• Marcaje con fluorocromos: Se emplea un anticuerpo conjugado anti-IgG humana marcado con FITC, complementado con anticuerpos fluorescentes específicos para linfocitos T (anti-CD3) y linfocitos B (anti-CD19).
• Obtención celular: Centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos para aislar la capa leucocitaria (buffy coat) y reconstitución con medio RPMI volumen a volumen.

Tratamiento con Pronasa

Los linfocitos B expresan receptores Fc inespecíficos en su membrana celular que pueden unir inmunoglobulinas por su fracción constante, generando falsos positivos. Por esta razón, el crossmatch en linfocitos B presenta mayor complejidad técnica. Para neutralizar esta interferencia se realiza una digestión enzimática con pronasa, encargada de degradar y remover estos receptores Fc superficiales.

Procedimiento Metodológico Paso a Paso

1. Separación de linfocitos totales del donante, obtención del suero del receptor y tratamiento enzimático celular con pronasa.
2. Incubación del suero del receptor junto con los linfocitos del donante.
3. Primer lavado celular para eliminar inmunoglobulinas no unidas.
4. Marcaje con el panel de anticuerpos conjugados a fluorocromos (anti-IgG, anti-CD3 y anti-CD19).
5. Segundo lavado celular.
6. Fijación de la suspensión celular con formalina (en caso de que la lectura no se efectúe de manera inmediata).
7. Adquisición y lectura en el citómetro de flujo.