Fundamentos de la Digestión, Cuantificación y Electroforesis de ADN

1. Digestión del ADN con Enzimas de Restricción

Introducción Histórica

Los descubrimientos de Arber y Linn (1969) y Meselson y Yuan (1968) sentaron las bases para entender que la restricción se produce como consecuencia de la acción de una endonucleasa capaz de cortar enzimáticamente el ADN infectante. Por otro lado, la modificación es el resultado de la metilación del ADN del hospedador.

La metilación de algunas bases en la secuencia de ADN reconocida por endonucleasas de restricción protege al ácido nucleico del organismo hospedador frente a la digestión por sus propias nucleasas. De esta forma, el organismo se vuelve inmune frente a la restricción.

Endonucleasas de Restricción Tipo II

• Reconocen sitios de ADN específicos que coinciden con el sitio del corte.
• Son muy estables y solamente necesitan Mg²⁺ como cofactor.
• Según Smith y Nathans (1973), cada enzima está representada por 3 letras derivadas del nombre del género de la bacteria de la cual la enzima es purificada. Por ejemplo, Hae proviene de Haemophilus aegypticus y Sma de Serratia marcescens.
• Es posible aislar dos o más enzimas de la misma cepa bacteriana.
• Las endonucleasas de tipo II reconocen secuencias de tetra-, penta- o hexanucleótidos en el ADN.
• Las secuencias de reconocimiento se escriben de izquierda a derecha en la dirección 5’ - 3’.

El Corte Hidrolítico

• El corte hidrolítico de las dos hebras de ADN ocurre dentro de la secuencia de reconocimiento.
• Ese proceso genera extremos 3’ o 5’ de simple hebra, ya sean recesivos o protuberantes, cuando la enzima corta produciendo extremos cohesivos (cohesive ends). Otras enzimas cortan generando extremos romos (blunt ends).
• Los extremos en el 3’ siempre llevan un grupo hidroxilo y los del 5’ siempre un grupo fosfato.
• El apareamiento de bases es complementario con otras moléculas de ADN que proporcionan los mismos extremos.
• Esta observación fue descrita por primera vez por Mertz y Davis (1972) cuando estudiaban la enzima EcoRI (G/AATTC).
• La digestión por endonucleasas de restricción está fuertemente influenciada por las condiciones de la reacción, tales como el pH, la concentración de sal, la presencia de Mg²⁺ y la temperatura.
• La desviación de las condiciones óptimas de la reacción podría cambiar la especificidad del corte.

Patrones de Corte

Patrón de corte de enzimas de restricción de tipo II:

• EcoRI -> Extremos 5'-Protuberantes (G|AATTC)
• BamHI -> Extremos 5'-Protuberantes (G|GATCC)
• HaeIII -> Extremos Romos (GG|CC)

La construcción del ADN recombinante necesita moléculas de ADN con extremos compatibles.

2. Cuantificación del ADN

Los ácidos nucleicos y nucleótidos libres poseen un máximo de absorción a 260 nm, por lo que es posible estimar su concentración.

La determinación de la razón A260/A280 es un parámetro que se utiliza para determinar el grado de pureza o la contaminación con proteínas del ácido nucleico aislado.

Si la razón es igual o mayor a 1.8, el nivel de pureza es adecuado para la mayoría de los procedimientos que se realizan a posteriori (por ejemplo, digestión con enzimas de restricción, amplificación, etc.).

Limitaciones y Relaciones de Absorción

Este índice no es capaz de discriminar cuando el ácido nucleico se encuentra intacto o degradado, así como tampoco es posible establecer mediante este índice si hay contaminación importante con algún otro ácido nucleico o incluso algún componente que también absorba a 260 nm.

Para un ácido nucleico purificado y sin degradación, se consideran las siguientes relaciones:

1. Solución de ARN con una concentración de 40 µg/ml presenta una A260 = 1.
2. Solución de ADN de doble hebra con una concentración de 50 µg/ml presenta una A260 = 1.
3. Solución de ADN de simple hebra con una concentración de 33 µg/ml presenta una A260 = 1.

3. Fraccionamiento Electroforético del ADN en Geles de Agarosa

Introducción y Principios Físicos

La electroforesis es usada para separar fragmentos de ADN en base a su tamaño molecular.

Si una macromolécula posee una carga neta $q$, la aplicación de un campo eléctrico $E$ tendrá como resultado la aplicación de una fuerza:

F = qE

Esa fuerza causará la aceleración de la partícula en un medio líquido hasta que se llega a una velocidad constante, $v$. A esta velocidad, las fuerzas de fricción son iguales y opuestas a la fuerza aplicada, de modo que:

v = qE/f

Con la definición del coeficiente de sedimentación, la movilidad electroforética ($u$) puede ser definida como la velocidad por unidad de campo:

u = v/E

Las unidades de movilidad electroforética son velocidad (cm/seg) dividida por campo (volt/cm); por lo tanto, se expresan como $ ext{cm}^2 ext{V}^{-1} ext{s}^{-1}$ (normalmente como $10^{-5} ext{ cm}^2 ext{V}^{-1} ext{s}^{-1}$ a 0 °C). Dado que la movilidad es proporcional a la razón entre la carga neta y el coeficiente de fricción, es posible utilizar la electroforesis para obtener información acerca de la carga relativa (para moléculas de la misma forma y tamaño) o del tamaño relativo (para moléculas de igual carga).

El Papel de la Agarosa

• La agarosa es un polímero capaz de formar una malla tridimensional.
• El gel de agarosa provee el soporte semisólido con poros por los cuales el líquido y las moléculas pueden migrar.
• La migración de moléculas lineales de ADN de doble hebra a través del campo eléctrico es inversamente proporcional al logaritmo decimal del número de pares de bases (pb).
• Las moléculas más grandes migran más lentamente debido a una mayor fuerza friccional y porque migran menos eficientemente a través de los poros del gel.
• La conformación del ADN es fundamental en la migración.
• La velocidad de migración relativa de las 3 formas depende primariamente de la concentración de agarosa en el gel, y también es influenciada por la intensidad de la corriente aplicada, la fuerza iónica del tampón y la densidad de superenrollamiento en la forma I del ADN.

Preparación de la Muestra y Corrida

• La muestra de ADN se mezcla con el tampón de carga y se aplica al gel.
• Este tampón contiene sacarosa, la cual aumenta la densidad de la solución y la lleva al fondo del pocillo.
• Contiene por lo menos un indicador del frente iónico que permite monitorear el avance de la electroforesis.
• A concentraciones de agarosa más bajas, los geles resultan con poros de mayor tamaño, lo que permite la separación de fragmentos de mayor tamaño, y viceversa.

Visualización del ADN

La distancia de migración en el gel varía de forma inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular. El tamaño de los fragmentos de ADN lineal se puede determinar calibrando el gel con estándares de tamaño conocido.

Para visualizar el ADN en el gel es necesario teñirlo.

El bromuro de etidio es una molécula pequeña y plana que se intercala entre las bases nitrogenadas del ADN. El bromuro de etidio emite luz al ser iluminado con una lámpara UV y es altamente mutagénico.