Fundamentos de Espectrometría de Masas y Proteómica Cuantitativa

1. Introducción a la Espectrometría de Masas

Un espectrómetro de masas mide moléculas según su masa, pero con una condición clave: las moléculas tienen que estar cargadas. Esto es fundamental; el espectrómetro no mide moléculas neutras, sino iones (moléculas con carga positiva o negativa). En proteómica, normalmente trabajamos con péptidos cargados positivamente.

Componentes del equipo

• Inlet: Entrada de la muestra, normalmente tras cromatografía líquida.
• Vacío: Entorno necesario para que los iones viajen sin colisionar con moléculas de aire.
• Fuente de ionización: Convierte analitos en iones en fase gaseosa.
• Analizador: Separa iones según su relación m/z (masa/carga).
• Detector: Convierte el impacto de los iones en señal eléctrica.
• Digitalización: Genera el espectro de masas (eje X: m/z, eje Y: intensidad).

2. Fuentes de Ionización

Las más importantes para proteómica son Electrospray y MALDI.

2.1. Electrospray (Electronebulización)

Técnica acoplada a cromatografía líquida. La muestra pasa por un capilar estrecho bajo un campo eléctrico, formando el cono de Taylor. Mediante evaporación asistida por nitrógeno, las gotas se reducen hasta liberar iones en fase gaseosa.

2.2. MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

La muestra se mezcla con una matriz (ácido orgánico) que absorbe la energía del láser, protegiendo al analito y facilitando su desorción e ionización.

3. Analizadores de Masas

El analizador separa los iones según su relación m/z.

• Cuadrupolo: Actúa como filtro de masas mediante voltajes DC y RF.
• Trampa iónica: Atrapa iones mediante un campo eléctrico y gas inerte (helio). Permite la eyección resonante.
• TOF (Time of Flight): Mide el tiempo de vuelo de los iones. El reflectrón mejora su resolución.
• Orbitrap: Utiliza oscilaciones de iones en un electrodo central para alta resolución y precisión.

4. Fragmentación de Péptidos

Para identificar secuencias, se rompen los péptidos generando fragmentos específicos:

• Serie b: Conserva el extremo N-terminal.
• Serie y: Conserva el extremo C-terminal.
• Serie a: Deriva de la serie b por pérdida de CO.

Técnicas de fragmentación

• CID (Collision Induced Dissociation): Colisión con helio. Presenta low-mass cut off.
• HCD (Higher-energy Collisional Dissociation): Fragmentación de alta energía sin low-mass cut off.
• ETD/ECD: Fragmentación química (transferencia/captura de electrones), ideal para modificaciones postraduccionales.

5. Estrategias de Análisis

• Bottom-up: Digestión previa de proteínas en péptidos.
• Top-down: Análisis de proteínas intactas (proteoformas).
• DDA (Data Dependent Acquisition): Selección de los iones más intensos (TOPn).
• DIA (Data Independent Acquisition): Fragmentación sistemática por ventanas de m/z.

6. Proteómica Cuantitativa

Estrategias para comparar abundancia de proteínas:

• Label-free: Comparación directa de intensidades iónicas o spectral counting.
• SILAC: Marcaje metabólico con isótopos estables en cultivo celular.
• iTRAQ / TMT: Etiquetas isobáricas que permiten multiplexación (varias muestras en un análisis).
• MRM (Multiple Reaction Monitoring): Técnica dirigida en triple cuadrupolo para validación y cuantificación absoluta.