Extracción y amplificación de ácidos nucleicos: PCR, tampones y reactivos
Resumen
El documento describe los componentes y procesos básicos para trabajar con ácidos nucleicos, incluyendo los tampones de lavado y TAE, las etapas del ciclo de la PCR y los reactivos esenciales como SYBR Green, dNTPs, ARNasa y proteinasa K. También explica la precipitación del ADN con etanol y el papel del detergente y de la sal en su solubilidad. Es una guía útil para repasar los fundamentos de la biología molecular de laboratorio.
Puntos clave
- El tampón de lavado elimina impurezas como sales, enzimas, agarosa, tintes y detergentes, que no se adhieren a la membrana de sílica durante la adsorción del ADN.
- El tampón TAE está formado por Tris, acetato y EDTA, y se usa en electroforesis en gel de agarosa; el Tris regula el pH.
- La PCR repite tres etapas: desnaturalización a 96 °C, templado o alineamiento a 55-65 °C y extensión a 72 °C.
- Los dNTPs son los nucleótidos trifosfato necesarios para sintetizar nuevas cadenas de ADN.
- La proteinasa K degrada las proteínas unidas al ADN y la ARNasa degrada el ARN para obtener un producto final limpio.
- El ADN es soluble en alcohol, pero insoluble en presencia de sal, porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfato.
Componentes y Procesos en la Purificación de Ácidos Nucleicos
Tampón de Lavado (Wash Buffer)
Durante el paso de la adsorción del ADN (utilizando el tampón PB), aquellas impurezas no deseadas, tales como sales, enzimas, agarosa, tintes, bromuro de etidio, aceites y detergentes, no se adhieren a la membrana de sílica, sino que fluyen a través de la columna.
Tampón TAE (Tris-Acetato-EDTA)
El TAE es una disolución tampón formada por Tris, acetato y EDTA, de uso frecuente en electroforesis, especialmente en geles de agarosa para separar ácidos nucleicos. El Tris es la molécula responsable del tamponamiento (regulación del pH).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La técnica de PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.
Etapas del Ciclo de PCR
- Desnaturalización (96°C): La reacción se calienta considerablemente para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
- Templado o Alineamiento (55-65°C): La reacción se enfría para que los cebadores (primers) puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
- Extensión (72°C): La temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.
Reactivos y Compuestos Esenciales
SYBR Green
El SYBR Green se emplea como colorante para la cuantificación de ADN de doble cadena en algunos métodos de PCR cuantitativa o para la visualización del ADN en la electroforesis con geles de agarosa.
dNTPs (Desoxinucleótidos Trifosfato)
Los dNTPs son los nucleótidos trifosfato necesarios para la síntesis de nuevas cadenas de ADN (por ejemplo, en la amplificación de ADN, secuenciación, rellenado de extremos, síntesis de ADNc y adiciones de colas de poli-T).
Solución de ARNasa
Es una nucleasa que cataliza la degradación del ARN en componentes más pequeños. Esto permite que nuestro producto final quede limpio de ARN.
Proteinasa K
Es una enzima que ayuda a romper o degradar las proteínas que se encuentran unidas al ADN.
Lisis y Precipitación del ADN
Etanol
Se utiliza como un disolvente que no se mezcla con el ADN, empleándose específicamente para precipitarlo.
Detergente
El detergente rompe la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo las interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína.
Solubilidad y Carga Eléctrica
El ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble en presencia de sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfato, facilitando su agregación.
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PDF Word HTMLPreguntas frecuentes
¿Para qué se usa el tampón TAE?
El TAE es una disolución tampón de Tris, acetato y EDTA que se usa frecuentemente en electroforesis, especialmente en geles de agarosa para separar ácidos nucleicos. El Tris es el componente responsable de regular el pH.
¿Cuáles son las etapas del ciclo de PCR?
El ciclo incluye la desnaturalización a 96 °C, el templado o alineamiento a 55-65 °C y la extensión a 72 °C. En la extensión, la Taq polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN.
¿Por qué el ADN precipita en presencia de sal y etanol?
En presencia de sal (NaCl), el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfato, lo que facilita la agregación del ADN. El etanol, que no se mezcla con el ADN, se emplea específicamente para precipitarlo.
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