Fundamentos y Funcionamiento de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

HPLC: Técnica analítica fundamental para separar, identificar y cuantificar mezclas complejas. En 1941, Martin y Synge propusieron que el uso de partículas pequeñas y altas presiones aumentaría drásticamente la eficiencia respecto a la cromatografía en columna clásica, ya que en esta última los tiempos de análisis eran excesivamente largos, se requerían grandes volúmenes de fase móvil y se utilizaban partículas de 40-200 µm.

Ventajas del HPLC

• Análisis más rápidos: Optimización del tiempo en laboratorio.
• Menor volumen de muestra: Mayor eficiencia en el uso de reactivos.
• Mayor capacidad de cuantificación: Precisión superior en los resultados.

Instrumentación del Sistema

• Reservorio de fase móvil: Es el punto de partida donde se encuentra el solvente, el cual debe estar rigurosamente desgasificado y filtrado (0.45 µm).
• Bomba: Componente que succiona la fase móvil del reservorio y la impulsa a alta presión hacia el resto del sistema.
• Inyector (Válvula Rheodyne): Punto crítico donde se introduce la muestra en la corriente de la fase móvil proveniente de la bomba; utiliza un loop de volumen fijo (10 a 50 µl).
• Columna y soporte: Considerada el corazón del sistema donde ocurre la separación física. Está construida habitualmente de acero inoxidable (Cr-Ni-Mo). El soporte es el relleno interno (normalmente sílice microporosa) que contiene la fase estacionaria con partículas de 3 a 10 µm y un área superficial de aproximadamente 500 m²/g.
• Detector: Recibe la mezcla ya separada a la salida de la columna y genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad de cada componente presente.

Modalidades de Separación

Fase Reversa (La más utilizada)

Se caracteriza por emplear una fase estacionaria no polar (Octadecilo C18) y una fase móvil polar (como la mezcla agua/metanol). En esta modalidad, eluyen primero los compuestos más polares.

Fase Normal

Utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar (por ejemplo, heptano). En este caso, eluyen primero los compuestos menos polares.

Tipos de Elución

• Elución Isocrática: La composición de la fase móvil permanece constante durante todo el tiempo que dura el proceso.
• Elución en Gradiente: La composición de la fase móvil cambia con el tiempo; esta técnica permite separar mezclas complejas de forma más veloz y eficiente.

Factores de Optimización

• Temperatura: Al incrementarla, se reduce significativamente el tiempo de análisis.
• Flujo: Los flujos mayores reducen el tiempo de proceso, aunque incrementan la presión interna en el sistema.
• pH: Es un parámetro crítico para mejorar la selectividad y la retención de solutos ionizables.

Detectores en HPLC

• UV-VIS (43%) y DAD (22%): Son los más comunes en la industria; detectan compuestos con dobles enlaces y estructuras aromáticas.
• Fluorescencia (10%): Un método altamente selectivo y sensible, ideal para la detección de hidrocarburos policíclicos.
• Índice de Refracción (8%): Conocido como el detector universal; se emplea principalmente para el estudio de azúcares y ácidos orgánicos.
• Conductividad: Específico para la detección y cuantificación de aniones como cloruros, nitratos y sulfatos.