Fundamentos y Metodología de la PCR Cuantitativa a Tiempo Real (qPCR)

PCR Cuantitativa a Tiempo Real (qPCR)

La **qPCR** (PCR Cuantitativa a Tiempo Real) **monitoriza** el proceso de amplificación mediante el empleo de **productos fluorescentes**. La detección de **amplicones** se realiza ciclo a ciclo. La qPCR incorpora un **lector de fluorescencia** de manera que puede medir la intensidad de fluorescencia de cada tubo.

Ventajas de la qPCR

• Mayor **rapidez de detección** cualitativa de **secuencias diana** en una muestra.
• Resultados más **fidedignos**.
• Minimiza los problemas de **contaminación**.
• Permite la **cuantificación** de amplicones y del **ADN diana inicial** presente en la muestra.

Cinética de Amplificación

La cinética de amplificación se divide en tres fases principales: **fase de ruido** (o basal), **fase de crecimiento exponencial** y **fase de meseta**.

Sistemas Fluorescentes de Detección de Amplicones

Sistemas de Detección Independientes de Secuencia

Estos sistemas se basan en el empleo de **agentes fluorescentes intercalantes**. Estos agentes **aumentan su fluorescencia** cuando se intercalan en la **doble hélice de ADN**. La medición se realiza al final de cada ciclo de amplificación. Este método tiene una **baja especificidad**.

Sistemas de Detección Específicos de Secuencia

Utilizan **sondas oligonucleotídicas** marcadas con **fluorocromos** que hibridan de manera específica a la región central del amplicón. La fluorescencia se asocia solo a los **productos deseados**.

Sondas de Hidrólisis (TaqMan)

Son **oligonucleótidos sintéticos** que poseen un **fluorocromo donante** (o notificador) en el extremo 5' y un **quencher** (o extintor) en el extremo 3'. La sonda hibrida en la región central del amplicón.

Balizas Moleculares (Molecular Beacons)

Son un tipo especial de **sondas oligonucleotídicas** específicas para qPCR. En condiciones normales, toman una forma de **horquilla** (*hairpin*) con la región central formando un bucle, manteniendo el **notificador** y el **quencher** muy próximos (fluorescencia apagada). Cuando el **ADN molde** se une a la sonda, los extremos se separan, el fluoróforo se aleja del quencher y se **emite fluorescencia**.

Sondas FRET (Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia)

Consisten en una **pareja de sondas** que hibridan en la zona central del amplicón en **regiones adyacentes** pero diferentes.

Aplicaciones de la PCR a Tiempo Real (qPCR)

La qPCR permite **cuantificar la cantidad inicial** de una molécula de **ácido nucleico** (ac. n.) en una muestra.

Tipos de Cuantificación

Cuantificación Absoluta

Expresa el resultado final en **unidades de concentración** o en **copias por unidad de volumen**.

Cuantificación Relativa

Expresa la **concentración** de la secuencia diana en **relación** con la concentración de un **gen de referencia** (o gen normalizador).

Curvas de Fusión (Melting Curves)

Es la **gráfica** que se obtiene representando la **fluorescencia** frente a la **temperatura** (Tª). Se utiliza para verificar la especificidad del producto amplificado.