Tipos de PCR y sistemas de detección en qPCR: resumen de fundamentos

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica fundamental en biología molecular que permite obtener millones de copias idénticas de un fragmento específico de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.

Componentes y Mecanismos Básicos

• Primers (Cebadores): Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria a las regiones que flanquean el fragmento a amplificar.
• Mezcla de Reacción: Contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio para que la PCR se desencadene de forma adecuada.

Tipos Principales de PCR

PCR Estándar (Convencional o Básica)

Es la forma más simple de PCR. Se amplifica un único fragmento de ADN, utilizando un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.

PCR Anidada o Nested-PCR

Consiste en la realización de dos reacciones de PCR acopladas. La segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación obtenidos en la primera reacción.

PCR Múltiple o Multiplex PCR

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo y en una sola reacción de PCR.

PCR con Transcripción Inversa (RT-PCR)

La RT-PCR (del inglés *Reverse Transcription-PCR*) permite amplificar y analizar moléculas de ARNm, mediante la conversión previa del ARN a ADN complementario (ADNc).

PCR en Tiempo Real (qPCR)

En la PCR a tiempo real, el proceso de amplificación se monitoriza continuamente mediante el empleo de productos fluorescentes. La detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo, permitiendo cuantificar el material inicial.

Sistemas de Detección en qPCR

Los sistemas utilizados para la detección de los productos amplificados se clasifican según su especificidad:

Sistemas de Detección Independientes de Secuencia

Se basan en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes que se unen al ADN de doble cadena a medida que se forma.

Sistemas de Detección Específicos de Secuencia

Se basan en la utilización de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan de manera específica en la región central del amplicón.

Control de Calidad y Preparación de Muestras

Control Positivo Interno

Consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados para amplificar una secuencia control que, obligatoriamente, debe estar presente en el ADN molde problema.

Homogeneización de Tejidos

La homogeneización es el tratamiento mecánico o químico al que se somete un tejido para liberar las células que lo integran, facilitando la extracción de ácidos nucleicos.

Homogeneización Mecánica

Consiste en someter el tejido a una acción trituradora o abrasiva para desmenuzarlo.

Homogeneización Química

Consiste en someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes que disgregan las células degradando los componentes tisulares.