Hemoglobina

2.3.1. Mioglobina : Casos bien conocidos de proteínas globulares son los de la mioglobina y la hemoglobina. Quizá la proteína globular más estudiada y mejor conocida sea la hemoglobina, fácilmente aislable y purificable a partir de eritrocitos. Fue la primera proteína cristalizada, caracterizada por ultracentrifugación, la primera que permitió identificar la causa molecular de una patología en proteínas. Asímismo fue la primera para la que se elaboraron teorías de cooperatividad. Posteriormente se identificó otra proteína de estructura más sencilla, con semejante función y que nos servirá para introducir el estudio de la hemoglobina. Se trata de la mioglobina. Esta proteína capta oxígeno procedente de la hemoglobina y se encuentra presente en el músculo y otros tejidos. La mioglobina es una proteína formada por una única cadena polipeptídica, que posee 8 hélices nombradas de la A a la H (desde el extremo N terminal). Mayoritariamente son hélices , en algunos tramos modificadas: en el extremo carboxilo de 4 de las 8 hélices se forman hélices 310 (3 restos por vuelta); esta hélice es más delgada y de mayor paso de rosca que la . Puede sufrir más interferencias, por lo que es menos abundante que la hélice y se da en regiones cortas. Suele estar al final de una hélice , alrededor de un giro distorsionado. Los segmentos no helicoidales de mioglobina se nombran con las dos letras de los segmentos helicoidales que la flanquean (AB, etc). Asociada a la parte proteica existe una parte no proteica, el grupo hemo, situado en una cavidad hidrofóbica con la que interaccionará por enlaces de van der Waals. El gupo hemo contiene un átomo de hierro en el centro de un anillo tetrapirrólico con el que enlaza por cuatro enlaces de coordinación con N. La quinta posición de coordinación del Fe se cubre con un resto de His (His F8, conocida como His proximal) y la sexta posición de coordinación la ocupará una molécula de oxígeno, cuyo almacenamiento constituye la función principal de la mioglobina y cuyo transporte a través de la sangre es función de la hemoglobina (enlace de coordinación es un enlace covalente en el que los dos electrones compartidos proceden del mismo átomo o ión). Próxima y por el lado opuesto al de la His proximal (respecto del plano del gupo hemo) se encuentra otro residuo de His, la E7 o His distal. Su función es impedir la alineación de los dos átomos de la molécula de oxígeno con el átomo de Fe, lo que provocaría la oxidación de Fe2+ a Fe3+ ; es decir, introduce un impedimento estérico que va a permitir una oxigenación del hierro en lugar de su oxidación. También se dificulta la unión extremadamente fuerte del CO o del CO2, por los que el grupo hemo aislado presenta mucha más afinidad que por el oxígeno. Además, la His distal actúa como una trampa de protones (recordad su pKa de 6 en el anillo de imidazol), impidiendo la acción catalizadora de los protones sobre la autoxidación del Fe2+, ya que el Fe2+ es reductor sobre los H+ , pasando a Fe3+ , y provocando el paso de O2 a O2-. . (la transición Fe2+ Fe3+ es simultánea con O2 O2-. , formación de superóxido). Así la His E7 protege de los protones que entrarían en la cavidad del hemo en la desoximioglobina. La unión de una molécula de oxígeno por el grupo hemo provoca un pequeño cambio conformacional al disminuir el volumen del átomo de Fe2+ ; en la desoxihemoglobina el Fe 2+ (recordad que Fe es d6) tiene alto spin, S=2, es paramagnético, por lo que su radio de van der Waals es grande, al pasar a oxihemoglobina, el Fe 2+ queda con bajo spin (S=0, diamagnético), por lo que disminuye su radio de van der Waals y se dispone en el plano de la porfirina, disminuye la distancia de los enlaces Fe - porfirina, lo que permite el acercamiento del átomo de Fe al plano del hemo, arrastrando a la His proximal y, así, al resto de la cadena polipeptídica. Al girar la hélice F (que contiene la His proximal), se transmite el giro a la hélice E, dejando más libre el acceso del O2. La curva de saturación de la mioglobina con oxígeno es hiperbólica (fracción de moléculas de MbO2/Mb total en función de pO2).

2.3.2. La hemoglobina, a diferencia de la mioglobina, es un tetrámero formado por dos tipos de subunidades diferentes, es 2 2 , relacionadas simétricamente. Las estructuras terciarias de y son muy semejantes a la de mioglobina, aunque sólo existe un 18% de identidad en los restos de aminoácidos (divergencia evolutiva con cambios conservativos). Las subunidades están asociadas de forma que interaccionan extensamente: 35 aminoácidos participan de la unión 1 1 (y su equivalente 2 2) , mientras las 1 2 (y 2 1) sólo afectan a 19 aa. Algunas de las interacciones son de tipo hidrofóbico, existen enlaces de hidrógeno y pares iónicos de gran importancia. La oxigenación provoca cambios en la estructura cuaternaria, afectando a la interacción 1 2 y 2 1, pero no afecta a 1 1 ni 2 2 . Así, el ángulo que forman los pares 2 2 y 1 1 varía en 15º, pasando así de un estado llamdo T (estado de baja afinidad por el oxígeno) a otro R (estado de alta afinidad por el oxígeno). La unión de la primera molécula de oxígeno presenta un efecto cooperativo positivo sobre las otras tres, facilitando su unión. Es el desplazamiento del hierro al interior del plano el que provoca estos giros y el paso de la subunidad de T a R. El estado T está estabilizado por puentes salinos (enlaces iónicos). El paso de T a R rompe estos puentes salinos, rotura impulsada por la energía de formación del enlace de coordinación Fe-Oxígeno. La presencia de los dos estados R y T justifica la cinética sigmoidal de saturación de la hemoglobina con oxígeno en función de la pO2: inicialmente la afinidad es baja (estado T) y finalmente la afinidad es alta (estado R). La transición de estado T a R tiene lugar por un desplazamiento de His F7 . La hemoglobina presenta el efecto Bohr, por el cual se liberan H+ al unirse al oxígeno (el cambio conformacional producido por la unión del oxígeno hace a la hemoglobina ligeramente más ácida); el efecto Böhr facilita la cesión de oxígeno a los tejidos que lo necesitan, ya que en los capilares, donde los tejidos liberan el CO2 generado a la sangre, los eritrocitos transforman el CO2 en bicarbonato, produciéndose la liberación de un protón ( CO2 + H2O H+ + HCO3- , reacción catalizada por la anhidrasa carbónica), protón que será capturado por la hemoglobina, disminuyendo su afinidad por el oxígeno; por esto se libera el protón (fíjate en que se liberará más oxígeno en las proximidades de los tejidos que más CO2 generen, es decir, aquellos que más oxígeno consuman). La disminución de pH provoca la disminución de la afinidad de hemoglobina por oxígeno ya que favorece la formación de puentes salinos que fijan el estado T: produce la protonación del N terminal en la subunidad y de una His en la (en C-terminal); al estar la His más cargada positivamente, puede interaccionar con un grupo carboxilo, en un enlace iónico (puente salino). La hemoglobina, además de transportar oxígeno en la dirección pulmones tejidos, también transporta CO2 en sentido contrario. Este transporte se lleva a cabo por la formación de carbamatos con el extremo amino, proceso que es más fácil en la forma desoxigenada de la hemoglobina; de manera recíproca, una elevada concentración de CO2 favorece la liberación de oxígeno por la hemoglobina (disminuye su afinidad). El CO2 transportado por la hemoglobina constituye aproximadamente el 13% del total de CO2 transportado hacia los pulmones (aprox 78% en forma de bicarbonato y 9% CO2 disuelto en la sangre y 13% unido a hemoglobina). Si bien el porcentaje de CO2 transportado no es muy alto, teniendo en cuenta el CO2 total presente en la sangre, lo cierto es que sólo cerca del 10% del CO2 total se recicla en cada vuelta de la circulación sanguínea, por lo que la importancia de la hemoglobina se ve aumentada, al transportar cerca del 50% del CO2 reciclado en cada vuelta. Existen dos modelos para explicar el comportamiento sigmoidal de la saturación de hemoglobina con oxígeno; el modelo simétrico o concertado (modelo de Monod-Changeaux-Wyman) y el modelo secuencial (de Koshland-Nemethy-Filmer). En el modelo concertado la proteína puede existir en dos estados conformacionales, un estado tenso, de baja afinidad por el ligando (T) y otro estado relajado, de alta afinidad (R); los dos estados están en equilibrio, pero todas las subunidades se encontrarían en todo momento en el mismo estado. Existirían, pues, sólo dos conformaciones para cada proteína y este modelo no puede explicar los casos de cooperatividad negativa presentes en la naturaleza. Estas dos restricciones las supera el modelo secuencial, en el que la unión del ligando provoca un cambio conformacional en la subunidad a la que se une, cambio que afecta a la afinidad de las subunidades vecinas; para este modelo el cambio conformacional sería como la caída de las fichas de dominó y los cambios conformacionales en las subunidades pueden favorecer o dificultar la unión de ligando a subunidades vecinas, lo que permitiría la exitencia de cooperatividad negativa. La hemoglobina es, además una proteína con sitios alostéricos: las curvas de unión son muy diferentes si se hace el ensayo en sangre o en un tubo de ensayo en el que no estén presentes todas las sustancias de la sangre. En sangre la hemoglobina presenta una afinidad menor por el oxígeno y la molécula responsable es el 2,3 bisfosfoglicerato (2,3 BPG), que se encuentra en los eritrocitos a una concentración aprox. de 4.7 mM (semejante a la concentración de hemoglobina). Esta molécula posee 5 cargas negativas a pH fisiológico e interacciona con restos de Lys e His y con los extremos N terminal de las cadenas . Así se estabiliza la conformación T. Los cambios conformacionales debidos a la unión de oxígeno provocan la distorsión del sitio de unión del 2,3 BPG, por lo que éste se disocia. La unión de estas moléculas a sitios distintos del sitio de unión del sustrato, molécula transportada, etc, es lo que define a las proteínas alostéricas. La hemoglobina fetal no posee cadenas sino cadenas , con lo que el sitio de unión del 2,3 BPG presenta menos grupos cargados y la unión es más débil. Por ello la hemoglobina fetal tiene más afinidad por el oxígeno que la hemoglobina materna, lo que permite la cesión del oxígeno de la madre al feto. El BPG interviene también en la adaptación a la vida o actividad a grandes altitudes. En estas condiciones el organismo aumenta la BPG en eritrocitos ya que, si bien la pO2 en los capilares sanguíneos se mantiene más o menos constante, en los alveolos pulmonares es menor cuanto mayor sea la altitud, con lo que el oxígeno liberado a los tejidos es menor (por una menor saturación en los pulmones); para que, con la misma pO2 se ceda más oxígeno a los tejidos se necesita disminuir la afinidad de hemoglobina por el O2. Esto se consigue aumentando la concentración del modulador alostérico negativo. Además, en un plazo de varios días (se completa en varias semanas) también se produce un aumento del nº de eritrocitos y de la concentración de hemoglobina en cada eritrocito. Una situación algo semejante se produce en los casos de patologías asociadas a hipoxia (insuficiencia pulmonar y anemias, aunque en éstas el problema no es la disponibilidad de oxígeno, sino la propia hemoglobina). La fracción de saturación de la hemoglobina con oxígeno, como hemos dicho anteriormente, muestra un perfil sigmoidal en función de la presión parcial de oxígeno. En una primera aproximación, suponiendo que la unión de las cuatro moléculas de oxígeno es simultánea, la ecuación de la curva de saturación sería de la forma Y = (pO2)4/((pO2)4+(P50)4) (en general sería Y = (pO2)n/((pO2)n+(P50)n ), mientras para la mioblogina sería Y= siendo K=pO2/(P50+pO2); entonces, Y= pO2/(P50+pO2) siendo P50 la presión parcial de oxígeno con la que se consigue la saturación de la mitad de las moléculas de hemoglobina en disolución. Sin embargo, los datos experimentales no se ajustan a esta ecuación con n=4; Archibald Hill demostró que la curva de unión de oxígeno a hemoglobina se podía ajustar a una ecuacióndel tipo Y/(1-Y) = (pO2/P50)n , siendo el valor de n = 4 el correspondiente al modelo concertado, de todo o nada, o cooperatividad infinita, y n=1 para el caso de la mioglobina, en el que no existe cooperatividad. El valor real para la hemoglobina es de n = 2.8 (entre 2.8 y 3.0). Se suele tomar logaritmos para la representación de la ecuación de Hill log(Y/(1-Y)) = n logpO2 - n log P50 y se representa log(Y/(1-Y)) en función de log pO2 En las curvas Y/(1-Y) v.s. pO2, la intersección de la asíntota superior con el eje de abscisas nos da el valor de la afinidad de la cuarta molécula de oxígeno unida, mientras la intersección de la asíntota inferior, el de la primera molécula unida. Si no existe cooperatividad, la representación de Hill es una recta. La representación de log (Y/(1-Y)) v.s. log pO2 es una recta cuya pendiente nos indica la cooperatividad (pendiente de 1 significa que no hay cooperatividad). La importancia de ciertos restos aminoacídicos y el carácter adaptativo de ciertas mutaciones se ponen de manifiesto en el caso de la anemia falciforme, enfermedad que se manifiesta por la presencia de eritrocitos en forma de hoz (de ahí su nombre). Los individuos con esta enfermedad poseen una mutación puntual en las cadenas , de modo que un resto de Glu específico cambia a Val. Se genera así la hemoglobina S (de "sickle", hoz en inglés). Estas cadenas provocan la agregación de las moléculas de hemoglobina por estas regiones hidrofóbicas así generadas, cambiando la forma de los eritrocitos al ser la proteína mayoritaria de estas células. Estos eritrocitos, en individuos heterozigotos, son menos capaces de transportar oxígeno. Lo chocante fue encontrar que individuos heterozigotos para esta mutación eran muy frecuentes en Africa ecuatorial, donde la malaria también es frecuente, y que, además eran resistentes a esta enfermedad. La explicación está en que el parásito de la malaria (Palsmodium falciparum) tiene una etapa de su ciclo vital dentro de los eritrocitos del huésped y consume su oxígeno. Al portar menos oxígeno, los parásitos no pueden sobrevivir en los heterozigotos para hemoglobina S (en homozigosis sería letal para el portador de la mutación). Existen muchas mutaciones en el gen de la hemoglobina que provocan patologías. Genéricamente se conocen como talasemias: síntesis de globinas deficientes (globina es la proteína de la hemo- o de la mio-globina). Cerca del 5% de la población mundial es portadora de alguna de estas mutaciones. En muchos casos se producen anemias hemolíticas cuando los eritrocitos son inestables por la formación de depósitos de las hemoglobinas modificadas.