Técnicas DE Hibridación DE Ácidos NUCLEICOS

Hibridación en fase líquida.

·Híbrido sonda/secuencia diana se forma en Solución, normalmente en pocillos en placa microtiter. El híbrido se detecta Por métodos complejos.

·Estás técnicas se han desarrollado en Diagnóstico microbiológico y virológico.

Hibridación en fase sólida.

·Técnicas de hibridación en soporte sólido se Caracterizan porque una de las dos moléculas, la secuencia diana o la sonda se Inmovilizan sobre un soporte sólido previo a hibridación

·Habitual fijar previamente la muestra con la Secuencia diana e incubar con la sonda marcada para formar el híbrido.

·Dentro de estas técnicas, técnicas de transferencia O Blotting:

oSouthern blot, para separar y caracterizar el ADN.

oNorthern Blot, para separar y caracterizar ARN

oWestern Blot, para la transferencia de proteínas.

Y también los Microorrays, Donde la sonda se encuentra fijada al soporte y se incuba con el ácido nucleico Que se estudia.

Técnicas DE TRANSFERENCIA O BLOTTING.

Se usan para separar y caracterizar ADN y ARN.

La separación de ARN se denominó Northern blot, y la Transferencia de proteínas Western blot.

Se realiza primero electroforesis en gel para separar Moléculas por tamaño y carga, posteriormente se hace la transferencia a una membrana para identificar un fragmento específico de ADN , una molécula de ARN O una proteína, mediante la unión específica de otra molécula de ácido nucleico (sonda) para ADN o ARN, o un anticuerpo en caso de proteínas.

SONDA: fragmento de tamaño variable, que puede ser ADN o ARN que se une específicamente por complementariedad de bases a la secuencia Que se encuentra en la membrana de nylon junto con ciertos de fragmentos más.

Característica fundamental es que lleva alguna marca para Que pueda detectarse la unión e identificar la secuencia de interés a la cual Se unió.

SOUTHERN BLOT.

Técnica usada en laboratorios de biología molecular para Detectar secuencias de ADN.

Antes de realizar esta técnica hay que extraer y Purificar el ADN.

Una vez obtenido un ADN purificado se corta con enzimas De restricción para obtener fragmentos de diferentes tamaños.

Se hace una electroforesis en gel de agarosa para separar Los diferentes fragmentos de ADN según su tamaño.

A partir de aquí empieza la técnica. Se traspasa el ADN Del gel a una membrana de nailon. El paso de las bandas del gel a la membrana Se hace poniendo el gel sobre papel de filtro cuyos extremos estén en un Buffer. Sobre el gel se pone la membrana y encima toallas de papel con pelo. El Buffer asciende por capilaridad y arrastra al ADN desnaturalizado a la Membrana, donde se adhiere. Es paso puede durar horas dependiendo del tamaño Del ADN que se quiera traspasar (blot o copia), quedando en la membrana las Mismas bandas que aparecían en el gel. La membrana seca el gel, extrayéndole el ADN.

La membrana de nailon, se incuba en una solución salina Que contiene una sonda de ADN complementaria a una secuencia específica que se Quiere encontrar en la membrana.

Finalmente se revela con una película fotográfica o con Luz fluorescente.