Identificación Bacteriana: Fundamentos de Pruebas Bioquímicas y Métodos de Recuento

Fundamentos de las Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas son ensayos sencillos que permiten identificar microorganismos a partir de sus características metabólicas, como la actividad enzimática, la utilización de sustratos o su capacidad de crecer en determinadas condiciones. Para realizarlas, se cultiva el microorganismo en un medio que contiene un sustrato o inhibidor y, tras la incubación, se observan cambios como el crecimiento, el viraje de color de un indicador o la aparición de productos de degradación. También se pueden usar medios con sustratos de enzimas inducibles para demostrar su actividad. Es fundamental trabajar con cultivos frescos (18–24 h) y en condiciones óptimas de pH, temperatura y atmósfera.

Pruebas Enzimáticas Principales

• Oxidasa: Detecta una enzima de la cadena respiratoria. Si es positiva, aparece un color violeta. Permite diferenciar bacterias como las enterobacterias (negativas) de Pseudomonas (positiva).
• Catalasa: Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno; un resultado positivo produce burbujas. Sirve para distinguir estafilococos (positivos) de estreptococos (negativos), evitando realizarla en agar sangre para no obtener falsos positivos.

Metabolismo y Requerimientos de Oxígeno

La prueba OF (Hugh-Leifson) evalúa el metabolismo de la glucosa. Se utilizan dos tubos: uno con oxígeno y otro sin él (cubierto con parafina). El indicador cambia de verde a amarillo si se producen ácidos. Según el resultado:

• Solo el tubo con oxígeno amarillo: Bacteria oxidante.
• Ambos tubos amarillos: Oxidante y fermentadora.
• Solo el tubo sin oxígeno amarillo: Fermentadora.
• Ningún cambio: No utiliza la glucosa.

El crecimiento en tioglicolato permite ver la relación con el oxígeno: los aerobios crecen arriba, los anaerobios abajo y los facultativos en todo el tubo. La producción de ácido y gas se detecta en caldos con indicadores de pH y campana Durham: el cambio de color indica ácido y las burbujas, gas.

Detección de Enzimas y Vías Metabólicas

• Rojo de metilo (RM): Positivo si hay fermentación ácida (medio rojo).
• Voges-Proskauer (VP): Detecta acetoína (color rojo).
• ONPG: Indica fermentación de lactosa (amarillo).
• Hipurato: Positivo si aparece color azul-violeta.
• Citrato: Positivo si el medio pasa de verde a azul (uso del citrato).

Compuestos Nitrogenados y Aminoácidos

En la utilización de compuestos nitrogenados, la reducción de nitratos puede dar nitritos (rojo) o nitrógeno gaseoso (sin color tras añadir zinc). En la descomposición de aminoácidos:

• Indol: Anillo rojo si es positivo.
• H₂S: Precipitado negro.
• Desaminación/Descarboxilación: Cambios de color por formación de compuestos.
• Ureasa: Medio rosa por producción de amoníaco.

Los ensayos combinados como Kliger o TSI evalúan fermentación de azúcares, producción de gas y H₂S mediante cambios de color (amarillo = ácido, rojo = alcalino). Finalmente, el sistema IMViC (Indol, RM, VP, Citrato) se usa para identificar enterobacterias según sus resultados combinados.

Protocolo de Identificación Bacteriana

La identificación bacteriana requiere primero aislar el microorganismo en un cultivo puro. Después se siguen varios pasos:

1. Observación microscópica: Tinción de Gram y forma.
2. Estudio del crecimiento: Aspecto de las colonias en medios de cultivo.
3. Pruebas bioquímicas: Pueden ser primarias (orientan al grupo o género) y secundarias/terciarias (permiten identificar la especie).

Cuando las bacterias no crecen o no se observan bien, se utilizan métodos genotípicos (moleculares), que detectan ADN o ARN específico, o métodos serológicos. Actualmente existen sistemas automatizados que aceleran el diagnóstico.

Criterios Fenotípicos

• Morfología microscópica: Tinción de Gram, forma y agrupación.
• Morfología macroscópica: Aspecto de las colonias (color, forma, tamaño, textura).
• Pruebas bioquímicas: Estudio de enzimas, metabolismo y resistencia a antibióticos.

Métodos de Recuento Microbiano

Los métodos indirectos no cuentan células directamente, sino que estiman su número a partir de otros parámetros como:

• Cantidad de moléculas (ADN, proteínas).
• Peso seco (gravimetría).
• Turbidez del cultivo (turbidimetría), que es el más utilizado.

Los métodos directos sí cuentan microorganismos como unidades y pueden ser:

• Directos totales: Cuentan vivos y muertos (microscopía, cámara de recuento, contadores electrónicos, filtración).
• Directos culturales: Cuentan solo los vivos, destacando el recuento en placa (siembra en superficie o profundidad) y el método del número más probable (NMP).