¿Por qué se usan ddNTPs en la secuenciación de Sanger?

Los ddNTPs son análogos estructurales de los dNTPs que, al incorporarse a la cadena en crecimiento, detienen la síntesis de ADN. Compiten con los dNTPs en la reacción, lo que genera fragmentos de distintas longitudes.

¿Por qué está en desuso el método de Maxam y Gilbert?

Según el texto, solo permite la secuenciación óptima de fragmentos de 250 pb, lo que limita su utilidad frente a otros métodos.

Métodos de secuenciación del ADN: Maxam y Gilbert y Sanger

Resumen

El documento describe los métodos clásicos de secuenciación del ADN. Explica para qué sirve conocer la secuencia de un ADN y cómo funciona el método químico de Maxam y Gilbert, junto con el método enzimático de Sanger basado en nucleótidos terminadores de cadena.

Puntos clave

Conocer la secuencia de ADN permite definir mapas de restricción, estudiar polimorfismos o mutaciones, distinguir exones e intrones y predecir la proteína codificada.
El método de Maxam y Gilbert se basa en la rotura química del ADN marcado con 32P en residuos específicos.
En el método de Maxam y Gilbert, las cuatro alícuotas se separan en un gel de poliacrilamida y se leen por autorradiografía.
El método de Maxam y Gilbert está en desuso porque solo permite la secuenciación óptima de fragmentos de unas 250 pb.
El método enzimático de Sanger interrumpe la síntesis de la hebra complementaria mediante ddNTPs, análogos de los dNTPs que detienen la síntesis al incorporarse.
En el método de Sanger se usan cuatro tubos de reacción, cada uno con uno de los cuatro ddNTPs, y la secuencia se lee por el orden de las bandas en el gel.

Ponte a prueba

Métodos de Secuenciación del ADN

Métodos de Secuenciación Manual

La secuenciación del ADN es un proceso fundamental en la investigación actual en Biología. Los métodos de análisis de secuencia han experimentado un extraordinario avance.

La correcta definición de una secuencia de ADN proporciona información valiosa para:

Definir el mapa de restricción: Conocer sitios de corte para distintas enzimas de restricción.
Estudiar los polimorfismos y/o posibles mutaciones en un gen.
Obtener información sobre regiones codificantes (exones) y no codificantes (intrones).
Inferir los mecanismos que influyen en la expresión de un gen.
Predecir la secuencia de la proteína codificada por un gen.

Método de Maxam y Gilbert

Este método se basa en la rotura química del ADN.

El proceso se inicia marcando radiactivamente con ³²P uno de los extremos del ADN. El ADN marcado se divide en cuatro alícuotas que se someten a tratamientos químicos que provocan su rotura en residuos específicos.

Es esencial que las reacciones se lleven a cabo en condiciones controladas para producir pocas roturas por molécula de ADN.

El resultado final es un conjunto de moléculas de ADN de longitud variable, terminadas en un único nucleótido. Las cuatro alícuotas se cargan en un gel de poliacrilamida y se revelan por autorradiografía. La lectura de bases en cada calle conduce a la secuencia marcada.

Esta técnica está en desuso porque solo permite la secuenciación óptima de fragmentos de 250 pb.

Método enzimático de Sanger

Este método es la base de las variantes usadas para la secuenciación a gran escala del ADN.

En este método no se degrada el ADN, sino que se realiza la interrupción controlada de la síntesis de la hebra complementaria. Se usan cuatro tubos diferentes.

Dos conceptos fundamentales:

Síntesis a cargo de una ADN polimerasa
Uso de nucleótidos terminadores de cadena (ddNTPs)

El método consta de dos fases:

Fase de Síntesis Enzimática

Se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar la hebra complementaria y un oligonucleótido cebador que hibride con el extremo 3’. Se usa como cebador un oligonucleótido complementario a una región del vector adyacente al punto de inserción de la molécula clonada.

La característica diferenciadora de este método es el uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs), análogos estructurales de los deoxinucleótidos (dNTPs), que provocan la detención de la síntesis de ADN al incorporarse.

Los ddNTPs compiten con los dNTPs en la reacción.

La reacción se lleva a cabo añadiendo cada uno de los cuatro ddNTPs a cuatro tubos de reacción que contienen los dNTPs, la polimerasa, el cebador y la hebra molde de ADN.

Separación de Fragmentos

Para analizar las cuatro mezclas, se usan geles de poliacrilamida. El tamaño de la molécula indica la posición en la secuencia del ddNTP. El método original usaba dNTPs marcados radiactivamente con ³²P o ³⁵S y las bandas se analizaban por autorradiografía. La secuencia se leía a través de las posiciones de las bandas en el gel, empezando por la que había migrado más lejos, que representaba la cadena más pequeña.