Métodos de Separación Bioquímica: Precipitación Salina y Cromatografía Iónica

Precipitación con Sales (Salting-Out)

Fundamento Químico

La precipitación con sales, conocida como salting-out, se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas.

Las elevadas concentraciones salinas provocan que las proteínas formen agregados entre ellas y, consecuentemente, se precipiten.

Procedimiento de Separación

1. I. Precipitación de Proteínas

   Se mezcla el lisado con una solución salina concentrada y se centrifuga, lo que resulta en la sedimentación de proteínas.

   En el sobrenadante permanecen los ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles del lisado.

2. II. Precipitación de ADN

   El sobrenadante del paso anterior se transfiere a un tubo limpio. Se añade un volumen igual de isopropanol y se vuelve a centrifugar, obteniendo el precipitado de ADN.

3. III. Lavado y Resuspensión del ADN

   Se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol al 70-95%. Finalmente, se resuspende en agua destilada Milli-Q o en tampón TE, similar al método anterior.

Cromatografía

La cromatografía es un método físico de separación que permite la separación de los componentes (líquidos o gases) de una mezcla compleja.

Elementos Fundamentales de la Cromatografía

• Muestra o Analito: El componente de interés a separar.
• Fase Móvil: La fase que se mueve en una dirección definida y que transporta la muestra.
• Fase Estacionaria: Sustancia fija por la que se mueve la fase móvil, y que es responsable de la separación de los componentes de la muestra.

1. Cromatografía de Intercambio Iónico

Fundamento

Se basa en la unión electrostática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria.

• Si los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga positiva (+), se unen iones negativos (aniones).
• Si los grupos funcionales tienen carga neta negativa (-), se unen iones positivos (cationes).

Para la purificación de ácidos nucleicos (los cuales poseen carga negativa), se utiliza típicamente un intercambiador aniónico (que posee cargas positivas en la fase estacionaria).

Los grupos funcionales más utilizados en estos intercambiadores son el metilaminoetanol (MAE) y el dietilaminoetil (DEAE). En la cromatografía de intercambio iónico, la unión entre el intercambiador fijado en la fase estacionaria y la molécula de interés es reversible.

Esta unión dependerá del tipo de molécula que sea, de la concentración salina y del pH del medio.

Procedimiento Inicial

La columna de cromatografía se carga con la muestra, diluida en un tampón de baja salinidad.

En estas condiciones:

• Los ácidos nucleicos, al tener carga neta negativa (-), se unen a los grupos funcionales del intercambiador (que tienen carga +).
• Las proteínas, los polisacáridos y otros contaminantes del lisado con carga positiva (+) no se unen al intercambiador y eluyen de la columna.