Métodos de tinción de hongos

Las aguas Residuales suelen transportar bacterias, virus, hongos y parásitos procedentes De reservorios humanos o animales. En general estos microorganismos son de Origen fecal y no patógenos y pueden vivir de forma natural en el agua y en el Suelo, aunque la mayoría están unidos a los materiales en suspensión, lo que Explica su concentración en los lodos de decantación. Otros microorganismos Pueden estar asociados a la presencia de animales que viven en este entorno (ratas e insectos) o bien asociados a objetos contaminados con fluidos Biológicos (jeringas, preservativos, compresas higiénicas, apósitos, etc.) (Constans et al., 1998). El género Bacillus fue descrito por primera vez por Cohn y comprende un grupo de especies filogenética y fenotípicamente heterogéneas. Incluye más de 100 especies y sus miembros se consideran ubicuos. En una etapa Temprana de la clasificación de las especies del género Bacillus se tienen en Cuenta dos carácterísticas fundamentales: el crecimiento aerobio, la respuesta Positiva a la tinción de Gram, la forma bacilar y la formación de endospora. Esto hace que exista una gran cantidad de especies de este género ocupando una Gran variedad de hábitats. Debido a esto, la heterogeneidad en la fisiología, Ecología y la genética dificulta la clasificación del género o la Generalización sobre este. (Tejera et al.,2011). Aspergillus es un género Mitospórico que se caracteriza por la producción de hifas especializadas, Denominadas conidióforos, sobre los que se encuentran las células conidiógenas Que originarán las esporas asexuales o conidios. El conidióforo carácterístico De Aspergillus, aunque es una estructura unicelular posee tres partes bien diferenciadas: Vesícula (extremo apical hinchado), estipe (sección cilíndrica situada debajo De la vesícula) y célula pie (sección final, a veces separada por un septo, que Une el conidióforo con el micelio). Sobre la vesícula se disponen las células Conidiógenas, denominadas habitualmente fiálides.( Abarca, M. 2000).  La primera monografía del género Aspergillus Publicada reunía 150 especies, clasificadas en 18 grupos. Esta clasificación Estaba basada en la identificación clásica de las diferentes especies mediante La observación de sus carácterísticas morfológicas macro y microscópicas como Morfología de la colonia y pigmentación, tamaño y forma de las cabezas Conidiales, morfología de los conidióforos, fiálides y métulas, y presencia de Células de Hülle. En la clasificación de los hongos filamentosos, el tipo de Reproducción es un factor importante. Tradicionalmente, el género Aspergillus Se incluía dentro de los deuteromicetos (subd. Deuteromycotina) u “hongos Imperfectos”, porque en ellos no se había podido encontrar la forma sexual o Teleomórfica, es decir, sólo se les conocía la forma asexual o anamórfica y por Ello no podían clasificarse como ascomicetos, basidiomicetos o zigomicetos. Los Principales géneros en los que se agrupan las formas teleomórficas de Aspergillus son Eurotium y Emericella. (González, A. 2010). Este trabajo consite en el aislamiento e identificación De bacillus y aspegillus autóctonos de las lagunas de oxidación de la estación Depuradora de calceta con posible capacidad biorremediadora.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se desarrollo  en la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria De Manabi Manuel Félix López ESPAM MFL, se aisló e identifico Bacillus y aspergillus autóctonos de las aguas residuales de calceta a través De las técnicas como pruebas de impronta y pruebas bioquímicas mediante el Sistema miniaturizado API 20e . Para la identificación de bacillus sp y Aspergillus se aislaron las comunidades bacterianas y fúngicas que se Obtuvieron en los análisis microbiológicos iniciales lo cual se prepararó medios Específicos y se verificó que las colonias estén puras. La identificación en bacterias Se realizaró utilizando la tinción de GRAM en cultivos de 48 horas para poder Referirse a la morfología celular y para realizar una primera aproximación a la Diferenciación bacteriana, considerándose bacteria GRAM positiva a las Bacterias que se visualizaron de color violeta y bacteria GRAM negativa a las Que se visualizan de color rosa. La observación de estructuras fúngicas se Efectuó a través de pruebas de impronta con azul de lactofenol. Posteriormente Se realizaró pruebas de catalasa y Ureasa para conocer más detalladamente la Actividad bioquímica de las cepas identificadas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

AISLAMIENTO DE COMUNIDADES DE BACTERIAS Y HONGOS.

Se realizó el análisis microbiológico a Las aguas residuales sistema de lagunaje de la estación depuradora de Calceta, A través de un muestreo puntual con el objetivo de determinar la población Microbiana existente en cada una de las lagunas (Cuadro 1). 

Cuadro  1 Análisis microbiológico de las aguas residuales de la Estación Depuradora de Bolívar

Fuente: Laboratorio de Microbiología Ambiental.

Posteriormente se realizó el aislamiento De baterías en medio Agar nutriente con pH 6,8 y su temperatura 121ᵒC/15min de Y hongos en Agar Saboraud con condiciones adecuadas de pH 5,6 y temperatura 121ᵒC/15min, Con las respectivas pruebas de viabilidad para verificar que las colonias Estuvieran puras.

IDENTIFICACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS

Para la identificación de distintos tipos De Bacillus sp., se aplicó la técnica De tinción de Gram, posteriormente se evaluó la reacción de catalasa y demás Pruebas bioquímicas a través del sistema miniaturizado API 20e.

Cuadro  2 RESULTADOS DE CEPAS DE BACILLUS EN AGUAS RESIDUALES DE LA ESTACIÓN DEPURADORA DE CALCETA, BASADO EN CRITERIOS DE SELECCIÓN

IDENTIFICACIÓN DE CEPAS FÚNGICAS.

La técnica de tinción desarrollada con el Colorante azul de lactofenol permitíó evidenciar carácterísticas estructurales Del hongo aspergillus en varias cepas evaluadas, una de las cuales se Identificó como Eurotium estado perfecto del Aspergillus.

Foto 1: Tinción de Aspegillus Eurotium usando azul de lactofenol

Para la Identificación de Aspergillus se Realizó la purificación de las placas contenidas de hongos dejándolas 48 horas En incubación, procediendo después a realizar la técnica de tinción Desarrollada con azul de lactofenol que se emplea para observar hongos, Posteriormente se selecciónó las colonias para realizar las pruebas de Impronta, luego se cortó segmentos de cinta adhesiva transparente Aproximadamente de 1 cm2 , pegando los segmentos de cinta en un asa micológica, Agregándole una gota de azul de lactofenol en el portaobjetos con el lado Adhesivo de la cinta en la parte superior de hongo, colocándole la cinta sobre La gota de azul de lactofenol sobre la preparación, el que permitió evidenciar Las carácterísticas estructurales del hongo Aspergillus en estado perfecto conocido como Eurotium Con cuyo cuerpo es fructífero redondo de paredes plectenquimaticas