Toma de Muestra para el Diagnóstico Virológico: Técnicas y Procedimientos
Toma de muestra para el diagnóstico virológico
- La probabilidad de obtener un buen rendimiento diagnóstico depende de la calidad de la muestra recibida en el laboratorio.
- Para obtener muestras de alta calidad, debemos conocer el sitio o lesión donde se sospecha que esté el agente, de manera de pedir la secreción o el tejido donde el virus esté presente.
- Es importante también estimar el período en que se encuentra la infección, para solicitar la muestra en el momento de mayor replicación viral.
- Son determinantes la cantidad y calidad de la muestra, además de las condiciones en que es mantenida y el tiempo en que es transportada al laboratorio.
Técnicas diagnósticas
- Los virus son organizaciones macromoleculares que constan esencialmente de genoma (ácido nucleico de tipo ARN o ADN) y proteínas. Algunos de ellos presentarán, además, lípidos en su manto e hidratos de carbono unidos a las proteínas virales.
Tipo de muestra, material de recolección e instrucciones y precauciones
* Hisopado o cepillado (células epiteliales)
| Torunda o cepillo flexible, medio de transporte viral, unidad refrigerada.
| Se recogen células epiteliales donde está ocurriendo la replicación activa del virus. La torunda o cepillo de preferencia es de dacrón o plástico. En caso de necesitar aislamiento viral, la muestra debe enviarse en medio de transporte viral. Mientras se espera el traslado al laboratorio, conservar a 4 °C (no congelar).
* Sangre
| Tubo sin anticoagulante (tapa roja) para pruebas en suero; tubo con anticoagulante (tapa lila) para pruebas en sangre total, leucocitos o plasma.
| El volumen requerido depende de las técnicas. Las técnicas moleculares requieren menor volumen. Se recomienda entre 5-10 ml en adultos. Evitar la hemólisis. Mantener a 4 °C en caso de que el transporte al laboratorio tome más de un día (no congelar).
* Fluidos o secreciones
| Trocar para punción (LCR) o sonda fina (aspirado nasofaríngeo o traqueal), medio de transporte viral, unidad refrigerada.
| Las muestras respiratorias deben colocarse en medio de transporte viral. LCR, orina o leche materna no necesitan medio de transporte. Conservar a 4 °C.
* Deposición
| Frasco estéril o limpio, unidad de refrigeración.
| Se recomienda al menos 4 g de deposición. Mientras se espera el traslado al laboratorio, conservar a 4 °C.
Técnicas de diagnóstico viral
- Partícula viral → * Microscopía electrónica. * Aislamiento viral.
- Antígeno viral → * Inmunoanálisis: inmunofluorescencia, ELISA, radioinmunoanálisis, inmunoaglutinación e inmunocromatografía.
- Genoma viral → Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos: * PCR o RT-PCR. * PCR en tiempo real, secuenciación.
- Respuesta inmune específica antiviral → ELISA, inmunofluorescencia y Western blot.
Consideraciones sobre las técnicas
- Para la detección de la partícula viral completa, las técnicas de aislamiento viral o microscopía electrónica solo están disponibles en laboratorios especializados en virología y se encuentran generalmente reservadas para fines de investigación. Estas técnicas clásicas han sido reemplazadas por técnicas moleculares o inmunoensayos, que requieren menor infraestructura e implican menor tiempo de entrega de resultados.
- La característica de los virus de ser parásitos intracelulares implica que, para el aislamiento viral, se deban utilizar líneas celulares de cultivo, las cuales son “infectadas” por el virus viable presente en la muestra. Tras ello, se observan los cambios morfológicos de las células hospedadoras o efecto citopático, como consecuencia de una replicación viral efectiva.
- Todo aislamiento viral debe ser confirmado mediante técnicas de inmunodiagnóstico (inmunofluorescencia) o moleculares específicas, debido a que ningún efecto citopático es patognomónico de un virus en particular.
- Una de las mayores ventajas del aislamiento viral es la posibilidad de obtener altas concentraciones de virus completos, para posteriores estudios de caracterización genómica y antigénica, de sensibilidad antiviral y para conservación en biorrepositorios.
- Para detectar antígenos virales disponemos de múltiples técnicas de inmunoanálisis, las cuales se basan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo.
- Método directo: el anticuerpo específico contra el antígeno a detectar está acoplado a un marcador. Método indirecto: el anticuerpo anti-antígeno no posee marcador, y la formación del complejo antígeno-anticuerpo se evidencia mediante un segundo anticuerpo marcado, llamado anticuerpo secundario conjugado.
* Inmunofluorescencia: el anticuerpo está unido a una molécula que emite fluorescencia.
* Radioinmunoanálisis: el marcador en este caso es un isótopo radiactivo.
* ELISA (ensayo inmunoenzimático): el anticuerpo está acoplado a una enzima que, al reaccionar con un sustrato, produce un producto coloreado visible.
Genoma viral
- Entre sus principales ventajas está el poder detectar virus que no pueden ser aislados en cultivo celular, o en aquellas infecciones en las que la carga antigénica es muy baja como para ser detectada por inmunoanálisis.
- La desventaja principal es la posibilidad de contaminación y falsos positivos.
- La técnica prototipo de las TAAN (técnicas de amplificación de ácidos nucleicos) es la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), en la que se amplifica un segmento de ADN utilizando partidores específicos y una ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa).
- En los casos en que se deba detectar ARN viral, la amplificación debe estar precedida por un paso de transcripción reversa, donde el ARN es copiado a un “ADN copia (ADNc)”. Este ADNc será el molde que se utiliza en el posterior proceso de amplificación por la polimerasa.
- Los productos de amplificación podrán ser visualizados mediante distintos métodos: electroforesis en el caso de la PCR convencional, o mediante sondas fluorescentes que permiten la detección en la medida en que ocurre la amplificación (PCR en tiempo real), o mediante la hibridación en plataformas que permiten la detección de múltiples virus a la vez.