Protocolo para el Control Microbiológico del Agua

Análisis Microbiológico de Aguas

Bacterias Aerobias

Definición: Son todas las bacterias heterótrofas, aerobias y anaerobias facultativas, mesófilas y psicrótrofas capaces de crecer en un medio de agar nutritivo.

Medio de cultivo: Podremos utilizar un medio rico y enriquecido. Se disuelven los componentes por calentamiento hasta el punto de ebullición y disolución total del agar, evitando la formación de espuma. Ajustar el pH y repartir a razón de 15-20 ml en tubos de ensayo. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Procedimiento:

• Tomar tantos tubos de medio de cultivo como placas se vayan a utilizar.
• Fundir totalmente el medio, colocando los tubos al baño maría.
• Dejar enfriar a 45 °C aprox.
• Homogeneizar la muestra de agua.
• Mediante una pipeta depositar en la placa de Petri 1 ml del agua a analizar.
• Verter el medio contenido en cada tubo, a 45 °C sobre el agua depositada en cada una de las placas.
• Agitar suavemente mediante movimientos circulares y de traslación para homogeneizar la mezcla durante un minuto.
• El tiempo transcurrido desde que se deposita el agua hasta que se agrega el medio no debe ser superior a 10 minutos.
• Dejar solidificar, invertir las placas y colocarlas a la estufa a 37 °C durante 48 h.

Bacterias Coliformes

Definición:

• Coliformes totales: Son aquellas bacterias de morfología bacilar, Gram negativas, aerobias o anaerobias facultativas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y de gas a 37 °C en un tiempo de 48 h.
• Coliformes fecales: Son aquellas comprendidas en el grupo anterior que además son capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44 °C en un tiempo máx. de 24 h.

Escherichia coli: Bacteria coliforme generalmente indol positiva, citrato negativa, rojo de metila positiva que no produce acetilmetilcarbinol y capaz de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas entre 37 y 44 °C en un tiempo máximo de 24 h.

Medios de cultivo: El agua problema se siembra en el medio caldo lactosado que permite el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada produciendo ácido y gas que se detecta en la campana Durham. La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram positivos y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos entéricos Gram negativos.

Procedimiento:

• Coliformes totales:
  1. Los elementos del sistema de filtración que vayan a entrar en contacto con el agua a analizar deben estar estériles.
  2. Colocar un filtro de membrana estéril sobre el soporte de filtración.
  3. Filtrar 100 ml de la muestra de agua efectuando el vacío necesario.
  4. Lavar con 30 ml de agua disolución estéril.
  5. Retirar el embudo.
  6. Mediante pinzas transferir la membrana filtrante sobre el medio de cultivo contenido en una placa de Petri.
  7. Cerrar e invertir incubar a 37 °C durante 24 h.
• Coliformes fecales: Igual que lo anterior pero incubar la placa a 44 °C.

Preparación del Reactivo Citocromo Oxidasa (Kovacs)

El reactivo Kovacs-oxidasa debe ser incoloro y debe conservarse en frasco de vidrio topacio oscuro, cerrado con tapón de vidrio esmerilado y guardado en nevera. A pesar de tomar estas precauciones el tiempo máx. de duración es de 2 semanas.

Confirmación: Si la colonia aislada es fermentadora de lactosa con producción de gas y oxidasa negativa, la presencia de coliformes totales se considerará confirmada.

Estreptococos Fecales

Definición: Son cocos Gram positivos anaerobios aerotolerantes catalasa negativos y fermentadores de glucosa con producción de ácido láctico a 37 °C en un tiempo máx. de 48 h.

Medios de cultivo: El medio utilizado es el caldo azida de Rothe, es un medio que contiene azida que inhibe la cadena de transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de cadena de transporte de electrones por lo que no se ven amenazados por la azida.

Procedimiento:

1. Disponer en una gradilla una serie de tubos y con medio líquido caldo Rothe a simple y a doble concentración, según la tabla de NMP elegida.
2. Mediante pipetas estériles sembrar los tubos de la serie tomando los volúmenes de agua que se indican en la tabla.
3. Los volúmenes de 10 ml deberán sembrarse en tubos o frascos conteniendo medio a doble concentración.
4. Homogeneizar los tubos sembrados.
5. Incubar a 37 °C durante 48 h.

Interpretación: Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observa enturbiamiento y/o sedimento. La ausencia de turbidez o sedimento al cabo de 48 h se considera como negativo.

Clostridios Sulfito Reductores

Definición: Son aquellas bacterias de morfología bacilar, Gram positivas, anaerobias estrictas capaces de formar esporas y con actividad sulfito reductora. Algunas especies de Clostridium habitan en el tracto intestinal, otras en el suelo, etc.

Fundamento: El ensayo consiste en contar el número de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una sal de hierro, denominado de Wilson Blair. Estas colonias aparecen de color negro debido a la formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito.

Procedimiento:

1. Calentar la muestra de agua a baño termorregulado a 80 °C durante 5 min, dejando enfriar hasta 60 °C aprox.
2. Sembrar cada tubo de medio Wilson Blair, preparando como se ha indicado con 20 ml de agua a 60 °C.
3. Mezclar y enfriar rápidamente.
4. Sellar con aceite de parafina esterilizado con el fin de asegurar la anaerobiosis.
5. Incubar a 37 °C durante 48 h.

Tinciones y Pruebas Bioquímicas

Tinción de Gram

Fundamento: La tinción de Gram requiere la utilización de 4 soluciones en el siguiente orden:

1. Primer colorante: El colorante penetra en la pared celular y la tiñe, es el cristal violeta.
2. Solución mordiente: Se combina con el primer colorante y forma un complejo que es insoluble en el caso de las Gram positivas. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas ácidas o bases como una solución diluida de yodo.
3. Agente decolorante: Es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes como por ejemplo etanol-acetona.
4. Colorante de contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante. El colorante es la safranina que tiñe de color rojo.

Como resultado de la tinción de Gram, las bacterias Gram positivas se tiñen de violeta y las Gram negativas de rojo.

Pruebas Bioquímicas

• Agar sangre: Medio general rico en nutrientes, además es un medio diferencial.
• Agar MacConkey: Medio selectivo por contener sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de las no enterobacterias. Es también un medio diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH.
• Prueba citocromo oxidasa: Detecta la presencia de citocromo c en la bacteria.
• Prueba catalasa: Cuando se ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con $H_2O_2$ al 3% se producen burbujas de $O_2$.
• Agar citrato de Simmons: Este medio indica la capacidad de las bacterias para metabolizar el citrato. Contiene citrato como fuente de C, fosfato de amonio como fuente de fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH.
• Prueba del indol: Se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias. Si la bacteria posee la enzima, al añadir el reactivo Kovacs se producirá un anillo de color rojo en la superficie.
• Prueba del rojo metilo y Voges-Proskauer: Medios diferenciales utilizados para determinar productos finales de la fermentación de la glucosa.