Pruebas bioquímicas y enzimáticas en microbiología clínica

Metabolismo de Hidratos de Carbono y Pruebas Fermentativas

Oxidación-Fermentación (O-F)

• Fundamento: Oxidación en superficie con indicador de pH y carbohidratos usados.
• Utilidad diferencial: Enterobacterias (enterobacterias fermentadoras) y Pseudomonas (oxidadoras). Micrococcaceae (estafilococos fermentadores y micrococos oxidadores).
• Medio: Medio Hugh-Leifson con solución de carbohidratos al 10%.
• Observaciones: 1 hora alcalino.
• Tiempo de incubación: 48-72 horas o hasta 14 días.

Producción de Ácido y Gas

• Fundamento: Viraje de color por pH o formación de burbujas.
• Medio: Agua de peptona + carbohidratos al 10% + rojo de fenol al 1%.
• Resultados: De rojo a amarillo y presencia o ausencia de gas.
• Tiempo de incubación: 24-48 horas.

Prueba de la O-D-Galactosidasa (ONPG)

• Fundamento: Capacidad de fermentación de lactosa. Detección de la enzima galactosidasa + nitrofenil + rojo de fenol al 1%.
• Medio: Suero fisiológico + acetona + disco ONPG.
• Resultados: ONPG positivo (1 hora amarillo).
• Observaciones: Agar Kligler.

Metabolismo Proteico

Hidrólisis de Gelatina

• Fundamento: Permite la entrada en la célula mediante proteínas + agua + proteasa = polipéptidos. Capacidad proteolítica.
• Utilidad diferencial: Pseudomonas y Serratia.
• Resultados: Gelatina con zona líquida donde hay crecimiento.
• Observaciones: Esterilización por vapor fluente.
• Tiempo de incubación: 1-14 días.

Producción de Ácido Sulfhídrico ($H_2S$)

• Fundamento: Microorganismos productores de azufre y ácido sulfhídrico. Liberación de sulfuro de azufre.
• Utilidad diferencial: Pseudomonas y Serratia frente a Brucella y Proteus.
• Tipo de prueba: Con indicador de azufre + indol y ácido sulfhídrico en tubo o con acetato de plomo.
• Reacciones: Agua de hidrólisis (AH) o peptona (AHP o AHTA).
• Resultados: Sulfuro positivo con precipitado negro.
• Tiempo de incubación: 18-24 horas.

Descarboxilasas

• Fundamento: Enzimas que atacan el grupo carboxilo, produciendo aminas y dióxido de carbono ($CO_2$) en anaerobiosis, alcalinizando el medio.
• Medio: Caldo Falkow, aceite y vaselina.
• Resultados: Positivo color lila, negativo color amarillo.
• Observaciones: pH 6.
• Tiempo de incubación: 18-24 horas.

Pruebas Enzimáticas

Prueba de la Oxidasa

• Fundamento: Los microorganismos obtienen electrones del ATP por respiración. La oxidasa cataliza la transferencia de electrones del medio.
• Utilidad diferencial: Pseudomonadaceae positivo y Enterobacteriaceae negativo.
• Indicador: Óxido de p-fenilendiamina-indol.
• Medio: Agar sangre + reactivo de Kovacs.
• Resultados: Oxidasa positiva con color rosa marrón en 10-60 segundos.
• Observaciones: No utilizar agar sangre ni medio con glucosa, ya que esta última inhibe la reacción.

Prueba de la Coagulasa

• Fundamento: Coagula el plasma.
• Identificación: Staphylococcus aureus.
• Reacción: Plasma (0.5 ml) y 3 colonias.
• Observaciones: Dos pruebas, positivo y negativo. S. aureus produce fibrinolisina en 1 hora. Se utiliza plasma no citratado.
• Tiempo de incubación: 30 minutos.

Prueba de la Catalasa

• Fundamento: Producción de peróxido de hidrógeno tóxico. Poner en contacto con el producto genera catalasa y oxígeno ($O_2$).
• Utilidad diferencial: Streptococcus (negativo) y Staphylococcus (positivo).
• Reacción: Peróxido de hidrógeno al 33% en portaobjetos.
• Resultados: Aparición de burbujas.
• Observaciones: No usar medio sangre ya que contiene catalasa propia; el peróxido se descompone con la luz.

Prueba de la DNasa

• Fundamento: Capacidad de despolimerizar el ADN en nucleótidos mediante ácido clorhídrico (HCl) que enturbia el medio.
• Identificación: Staphylococcus aureus y Serratia marcescens positivos.
• Observaciones: Observar si se forma un halo grande.

Prueba de la Ureasa

• Fundamento: Cataboliza la urea en carbonato cálcico. Viraje de color por alcalinización del carbonato.
• Utilidad diferencial: Enterobacterias.
• Medio: Urea de Christensen.
• Resultados: Positivo color rojo.
• Observaciones: Indicador en tubo o medio de Stuart. Prueba rápida positiva para Proteus; algunas bacterias pueden tardar más de 6 días.

Reducción de Nitritos

• Utilidad diferencial: Diferenciación entre H y N.
• Reactivos: Reactivos 1 y 2, y zinc.

Pruebas IMVIC

Prueba del Indol

• Medio: Agua de peptona + indol de Kovacs.
• Fundamento: Sembrar 5 gotas de reactivo de indol y agitar suavemente.
• Resultados: Indol positivo con formación de un halo rojo.
• Observaciones: Medio sin glucosa.
• Tiempo de incubación: 48 horas.

Rojo de Metilo

• Fundamento: Detección de ácidos por fermentación de azúcares (vía ácido-mixta). Se produce gran cantidad de ácido.
• Medio: Caldo Clark y Lubs (MR-VP), rojo de metilo.
• Observaciones: No leer antes de 48 horas. Opcionalmente usar agua de peptona.

Voges-Proskauer (VP)

• Fundamento: Metabolismo neutro, formación de acetil metil carbinol o acetoína a partir de glucosa.
• Medio: Alfa-naftol y KOH al 40%.
• Procedimiento: Incubar 48-72 horas y añadir 0.5 ml de reactivo; inclinar el tubo para favorecer la oxidación de la acetoína durante 10-15 minutos.
• Resultados: VP positivo color rojo, de lo contrario amarillo.
• Observaciones: Si no se dispone de potásico, usar sódico. Si una prueba de VP es negativa, suele ser positiva para rojo de metilo (RM).

Prueba del Citrato

• Fundamento: Utilización del citrato como única fuente de carbono y sales de amonio como fuente de nitrógeno. Se forma amoníaco a partir de las sales y carbonatos, provocando un cambio de color por alcalinización.
• Medio: Citrato de Simmons.
• Fundamento técnico: Inocular dos tubos destapados.
• Resultados: Citrato positivo con viraje a color azul.
• Observaciones: No realizar un inóculo demasiado grande.
• Tiempo de incubación: 48-72 horas.