Reveladores en cromatografía
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4.2 Precipitación con sales (salting-out)Fundamentación La precipitación con sales se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas. -Las elevadas concentraciones salinas provocan que las proteínas formen agregados entre ellas y se precipiten. I. Precipitación de proteínas Mezclar lisado con una solución salina concentrada y centrifugar Sedimentación de proteínas. En el sobrenadante quedan los ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles de lisado. II. Precipitación de ADN El sobrenadante del paso anterior, se transfiere a un tubo limpio, se añade un volumen igual de isopropanol y se vuelve a centrifugar Precipitado de ADN.III. Lavado y resuspensión del ADN Se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol 70-95% y se resuspende en agua destilada milli-Q o en tampón TE como en el método anterior. 4.3 CromatografíaLa cromatografía es un método físico de separación, por lo que permite la separación de los componentes (líquidos o gases) de una mezcla.Elementos de una cromatografía:-Muestra o analito -Fase móvil: fase que se mueve en una dirección definida, contiene la muestra. -Fase estacionaria: sustancia fija por la que se mueve la fase móvil, y provoca la separación de los componentes de la muestra.4.3.1. Cromatografía de intercambio iónicoFundamentación Uníón electrostática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria. Si los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga (+), se unen iones (-) (aniones). Si los grupos funcionales tienen carga neta (-), se unen iones (+)(cationes).Para la purificación de ácidos nucleicos se usa un intercambiador aniónico (cargas +)ADN Carga negativa!! Al poner cargas positivas en la fase estacionaria el ADN se unirá. Los grupos más utilizados son el metilaminoetanol (MAE) y el dietilaminoetil (DEAE). En la cromatografía de intercambio iónico, la uníón entre el intercambiador fijado en la fase estacionaria y la molécula de interés es reversible. Esta uníón dependerá del tipo de molécula que sea, de la concentración salina y el pH del medio. Primer paso La columna de cromatografía se carga con nuestra muestra, diluida en un tampón de baja salinidad. En estas condiciones, los ácidos nucleicos tienen carga neta (-) y se unen a los grupos funcionales del intercambiador (tienen carga +). Las proteínas, los polisacáridos y otros contaminantes del lisado con carga (+) no se unen al intercambiador y eluyen de la columna.