Técnicas Analíticas en el Laboratorio Clínico: Espectrofotometría, Espectrometría, Cromatografía y Más
Finalidades de las magnitudes y secciones del laboratorio
El laboratorio clínico se organiza en diferentes secciones: automatización, orinas, hormonas, proteínas, líquidos biológicos y otras. Las pruebas bioquímicas se clasifican en básicas, especiales y de urgencias, y se realizan sobre muestras sanguíneas y de orina.
Técnicas espectrofotométricas
Radiación electromagnética (REM)
Teoría ondulatoria
Describe la radiación mediante sus parámetros característicos (amplitud, longitud de onda, frecuencia, etc.).
Teoría corpuscular
Considera la radiación como partículas de energía (fotones) y explica el espectro electromagnético.
Interacción radiación-muestra
Los fenómenos principales son la transmisión (T), la absorción (A), la dispersión, la reflexión y la difracción.
Espectrofotómetro
Partes
- Fuente de radiación
- Rendija de entrada
- Selector de longitud de onda
- Rendija de salida
- Cubeta
- Detector
Tipos
- De haz simple
- De doble haz en el espacio
- De doble haz en el tiempo
Espectrometría de absorción molecular
Se basa en la transmitancia (T) y la absorbancia (A), así como en el espectro de absorción. La ley de Lambert-Beer relaciona la absorbancia con la concentración, siempre que se cumplan sus condiciones de aplicación. Se deben considerar la linealidad y las posibles desviaciones.
Manejo del espectrofotómetro UV-VIS
Curvas de calibrado
Tipos de blanco:
- De cubeta
- De reactivo
Procedimiento de calibrado: mediante un factor de calibración o mediante una curva de calibrado, cuya construcción se describe paso a paso.
Tipos de medida
- Método colorimétrico
- Método enzimático
Técnicas: a punto final, de dos puntos y cinéticas.
Espectrometría en infrarrojo
Espectrometría de absorción atómica
Absorción atómica con llama
Componentes: fuente de radiación, sistema de atomización por llama, detector y sistema de medición y calibrado.
Interferencias: químicas, de ionización y de matriz.
Absorción atómica con atomización electrotérmica (GFAAS)
Instrumentación: lámpara de descarga sin electrodos y horno de grafito.
Espectrometría de emisión atómica
Los electrones de los átomos neutros excitados regresan a estados de energía inferiores, emitiendo luz. La energía de excitación puede provenir de calor, luz, electricidad o ondas de radio.
Espectrometría de emisión de llama (FAES)
Instrumentación: quemador-nebulizador.
Ventajas: espectro más sencillo e interferencias reducidas.
Calibración: con patrones externos.
Espectrometría de emisión molecular
Mide la intensidad de luz emitida por moléculas previamente excitadas. Incluye la fotoluminiscencia, que comprende la fluorescencia y la fosforescencia, con sus espectros de excitación y de emisión.
Espectrometría de fluorescencia
Mide la luz emitida por moléculas con anillos aromáticos o enlaces conjugados.
Instrumentación: lámpara de arco de xenón o mercurio, dos monocromadores, cubeta de vidrio o cuarzo y detector.
Quimioluminiscencia
La reacción química genera una molécula excitada que emite luz al volver a su estado fundamental. En ocasiones la reacción está catalizada por enzimas oxidasas.
Espectrometría de dispersión de radiación
El haz choca con partículas en suspensión y la luz es dispersada, según la ley de Rayleigh.
Turbidimetría
Se utiliza cuando las concentraciones son bajas (A < 6).
Nefelometría
Mide la intensidad de luz dispersada cuando las concentraciones son bajas (A < 3).
Refractometría de líquidos
La luz cambia de dirección al pasar de un medio a otro. La ley de Snell relaciona la variación de velocidad con el cambio de dirección.
Partes del refractómetro
- Prisma
- Lámpara
- Placa de paso de luz
- Lente
- Recipiente para la muestra
Fotometría de reflectancia
Química seca
Mide la intensidad de luz reflejada en una superficie tras una reacción química.
Componentes
- Fuente de luz
- Selector de longitud de onda
- Sistema óptico
- Reactivos
- Detector
- Sistema de lectura
Reactivos
Tiras reactivas y películas multicapa.
Fase preanalítica y analizadores automáticos
La fase preanalítica incluye la entrada de muestras, la centrifugación, la destaponadora, la alícuota y la clasificadora.
Dispositivos
Cubetas de reacción y sistema de medida.
Sistemas de comunicación
- Unidireccional: los datos de la solicitud se introducen manualmente y el analizador envía luego los resultados al ordenador.
- Bidireccional: el analizador capta las pruebas que debe efectuar y luego envía los resultados en tiempo real o por lotes.
Fase postanalítica
Incluye las pruebas reflejas y el archivo de muestras.
Sistemas totalmente automatizados
Ventajas: cinta transportadora, brazo robótico y sistema informático integrados.
Espectrometría de masas
Transforma las moléculas de una muestra en iones en estado gaseoso y los separa según su masa y carga.
Cromatografía
Cromatografía plana
Divide los componentes de la muestra; se coloca sobre un soporte y se sumerge en un gas o líquido, por lo que los componentes migran.
Cromatografía en columna
Separa, identifica y cuantifica compuestos volátiles y térmicamente estables.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La muestra es impulsada por una bomba de alta presión.
Según principios de interacción
- Exclusión molecular: separación en gel de moléculas según tamaño y forma.
- Intercambio iónico: las moléculas cargadas se desplazan hacia grupos de carga opuesta.
- De reparto: el analito se disuelve entre dos fases líquidas.
- De afinidad: separa sustancias que establecen uniones específicas.
- De absorción: los componentes fluyen con el medio líquido y se adhieren al sólido según su afinidad polar.
Otras técnicas electroquímicas y osmométricas
Osmometría
Mide el número de partículas disueltas en una solución.
Potenciometría
Mide la diferencia de potencial entre el electrodo indicador y el electrodo de referencia.
Amperometría
Mide la presión parcial de oxígeno (PO2) cuando se aplica una diferencia de potencial entre electrodos.