Técnicas de Biología Molecular: Extracción, Purificación, Cuantificación y Amplificación por PCR

Procesamiento, Manipulación y Estudio de Ácidos Nucleicos

1. Preparación y Dispensación de Disoluciones y Reactivos

Todos los reactivos de biología molecular (BM) se preparan con agua bidestilada libre de ADNasas y ARNasas. En biología molecular se trabaja habitualmente con volúmenes muy pequeños (picolitros [p], nanolitros [n], microlitros [µ], mililitros [m]) y concentraciones molares bajas (milimolar [mM] o micromolar [µM]). Las soluciones de trabajo suelen prepararse a partir de una solución concentrada (stock o madre), la cual presenta una concentración superior a la disolución de uso final 1x.

2. Manejo de Micropipetas

Las micropipetas permiten transferir volúmenes pequeños a tubos tipo Eppendorf. La capacidad máxima que el dispositivo puede dispensar viene indicada en la parte superior del émbolo, mientras que en la ventana lateral se especifica el intervalo de volumen permitido.

3. Propiedades Físico-Químicas de los Ácidos Nucleicos

Los ácidos nucleicos (AN) son macromoléculas con características biofísicas particulares:

• Solubilidad: Son solubles en agua debido a que los grupos fosfato y los grupos hidroxilo (-OH) forman puentes de hidrógeno con las moléculas de H₂O.
• Acidez: A pH fisiológico, los ácidos nucleicos presentan cargas negativas y se comportan como ácidos debido a la ionización de sus grupos fosfato.
• Viscosidad: Deriva de la rigidez relativa de la molécula y de su gran longitud. El ADN es más viscoso que el ARN.
• Densidad: Está directamente relacionada con la proporción de pares de bases guanina-citosina (G-C).
• Desnaturalización: La doble hélice puede separarse en dos hebras sencillas mediante calor o agentes químicos. El calor necesario debe ser proporcional a las bases contenidas en la cadena, ya que determina la rotura de los puentes de hidrógeno (los pares adenina-timina [A-T] tienen 2 puentes de hidrógeno, mientras que citosina-guanina [C-G] tienen 3 puentes de hidrógeno).
• Absorbancia: Capacidad del ADN de absorber luz en la región del espectro electromagnético correspondiente a la radiación ultravioleta (a 260 nm). Las cadenas simples de ADN absorben mayor cantidad de radiación UV que la cadena doble, fenómeno denominado efecto hipercrómico.
• Hibridación: Cuando las cadenas desnaturalizadas se enfrían (la temperatura desciende), son capaces de volver a unirse emparejándose con secuencias de bases complementarias.

4. Enzimas Relacionadas con los Ácidos Nucleicos

Las técnicas de biología molecular emplean enzimas para romper, replicar y ligar el ADN de forma controlada:

• Nucleasas: Enzimas hidrolasas que cortan los ácidos nucleicos rompiendo el enlace fosfodiéster entre la ribosa/desoxirribosa de un nucleótido y el grupo fosfato del siguiente.
• Ligasas: Enzimas de origen bacteriano que unen covalentemente extremos de moléculas de ADN.
• Polimerasas: Sintetizan y amplifican ácidos nucleicos incorporando nucleótidos en dirección 5' → 3'. Existen dos tipos principales:
  • ADN polimerasa dependiente de ADN: Sintetiza ADN a partir de una cadena molde de ADN (ej. ADN Polimerasa I de E. coli, T4 polimerasa y polimerasas termoestables).
  • ADN polimerasa dependiente de ARN (Retrotranscriptasa): Sintetiza copias de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN; se utiliza en clonación, síntesis de sondas y estudios de expresión.

5. Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

La obtención de ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica suele realizarse mediante un protocolo continuo dividido en tres fases principales:

Fase 1: Pretratamiento de Muestras

Determinado por el tipo de material de partida para obtener suspensiones celulares (células libres y agregados celulares dispersos en medio líquido):

• Sangre periférica: El material genético se obtiene de los leucocitos. Se aconseja realizar la extracción dentro de las primeras 24 horas tras la recogida (lisis de glóbulos rojos y obtención de células mononucleares para detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos de retrovirus, entre otros).
• Cultivos celulares: Requiere recolectar las células antes de la extracción, ya sea en cultivo en suspensión o en monocapa (células adheridas a la superficie).
• Tejidos animales o vegetales: Requieren homogeneización mecánica o química para disgregar el tejido y liberar las células. La cantidad de tejido a procesar depende del tipo de tejido, método de homogeneización y protocolo de extracción:
  • Homogeneización mecánica: Acción trituradora o abrasiva; puede ser automatizada (aparatos mecánicos) o manual (para minimizar la rotura o cizallamiento del material).
  • Homogeneización química: Empleo de proteasas y detergentes para degradar componentes celulares y disgregar el tejido.
• Tejidos fijados en formol o embebidos en parafina (FFPE): Requieren un proceso previo de desparafinado para eliminar la parafina.
• Otras muestras:
  • Cultivos de bacterias y levaduras: Resuspensión directa de las colonias en un tampón de suspensión.
  • Células de la mucosa oral: Centrifugación de la suspensión celular y eliminación del sobrenadante.
  • Esputo: Fluidificación previa con agentes mucolíticos.

Fase 2: Extracción y Lisis Celular

Consiste en la obtención de un lisado celular homogéneo donde los ácidos nucleicos queden libres de las estructuras que los confinaban:

• Detergentes: Desestructuran la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizan las proteínas insertadas en ella (ej. SDS).
• EDTA: Agente quelante de cationes divalentes como el Ca²⁺ y el Mg²⁺. Facilita la rotura de membranas, desestabiliza proteínas y elimina la actividad de las nucleasas al privarlas de sus cofactores esenciales.
• Agentes caotrópicos: Desnaturalizan macromoléculas, inactivando nucleasas e impidiendo su actividad degradativa.
• Tratamiento en células con pared celular (bacterias, levaduras, hongos y vegetales): Dificulta la lisis, requiriendo:
  • Tratamiento enzimático: Lisozima (para bacterias Gram positivas) o liticasa (para degradar la pared de levaduras y hongos).
  • Tratamiento mecánico: Ebullición en agua destilada, ciclos de congelación-descongelación o sonicación.
  • Tratamiento con CTAB: Específico para paredes celulares vegetales con alto contenido en polisacáridos y compuestos polifenólicos.
• Verificación de la lisis: Comprobar que la mezcla resultante es una solución completamente homogénea.
• Consideraciones específicas: Para purificar ADN sin interferencias de ARN, es necesario añadir ARNasa A e incubar entre 15 y 45 minutos a 37 °C (en sangre periférica o médula ósea la presencia de ARN suele ser residual y no siempre imprescindible).

Fase 3: Purificación de Ácidos Nucleicos

Separación de los ácidos nucleicos del resto de componentes celulares mediante distintos métodos:

• Purificación con disolventes orgánicos: Basada en la diferente solubilidad de los compuestos:
  1. Eliminación de compuestos solubles en disolventes orgánicos (proteínas y lípidos).
  2. Precipitación del ADN: El ADN tiene carga negativa debida a los fosfatos. En medio acuoso las moléculas se repelen rodeándose de agua; al añadir alcohol (etanol o isopropanol), este actúa como deshidratante, elimina el agua y neutraliza las cargas, induciendo la agregación y precipitación de las hebras de ADN.
  3. Lavado del ADN: El ADN es insoluble en etanol al 70 %, pero las sales y contaminantes precipitados sí se disuelven, facilitando su retirada.
  4. Resuspensión del ADN en agua pura o tampón TE.
• Precipitación con sales (Salting out): Precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas que reducen drásticamente su solubilidad en agua. Consta de: precipitación proteica, precipitación del ADN, lavado y resuspensión final.
• Otros métodos manuales: Kits comerciales con columnas de sílice (protocolos rápidos, reproducibles y seguros que minimizan centrifugaciones complejas) o microesferas magnéticas, a las cuales se une el ADN mientras se descarta el lisado por decantación o aspiración; tras sucesivos lavados con etanol, las esferas se retienen con un imán para eluir el ADN puro.
• Métodos automatizados: Indicados cuando el volumen de muestras del laboratorio es elevado. Permiten aislar ADN o ARN de diversos tejidos y fluidos con mínima manipulación.
• Extracción de ARN: Proceso más delicado debido a su alta inestabilidad y a la ubicuidad de las ARNasas. Comprende lisis celular rápida, solubilización del ARN y precipitación bajo estrictas condiciones libres de ribonucleasas.

6. Cuantificación y Estimación de Pureza del ADN

La cuantificación precisa es fundamental para ajustar las concentraciones en reacciones enzimáticas posteriores mediante espectrofotometría:

• Fundamento: La luz emitida por la lámpara atraviesa un monocromador o prisma que selecciona la longitud de onda adecuada, incide sobre la cubeta de la muestra y el detector mide la luz transmitida. La luz retenida define la absorbancia.
• Ley de Lambert-Beer: Relaciona la luz absorbida con la concentración de la muestra (a mayor concentración, mayor absorbancia y menor luz transmitida):
  Concentración (µg/ml) = A260 × 50 × Factor de dilución
• Estimación de la pureza: Se calcula mediante el cociente de absorbancias A260 / A280:
  • ADN sin contaminantes: Ratio entre 1,7 y 2,0.
  • Contaminación por proteínas o fenoles: Ratio ≤ 1,6 (requiere tratamiento con proteinasa K o repetición del lavado fenol-cloroformo y precipitación con etanol).
  • Contaminación por ARN: Ratio > 2,0 (requiere digestión con ARNasas).
  • ARN puro: Ratio óptimo entre 1,8 y 2,1.
• Absorbancia a 320 nm (A₃₂₀): Indica turbidez y presencia de partículas en suspensión; este valor basal debe restarse de las lecturas a 260 nm y 280 nm antes de calcular las razones de pureza y concentración.

7. Digestión Enzimática con Endonucleasas de Restricción

Cortar ADN con enzimas de restricción es habitualmente el primer paso en el estudio genético, seguido de la separación electroforética y visualización de fragmentos.

Componentes de la Digestión Enzimática

• Enzimas de restricción (Endonucleasas): Rompen enlaces fosfodiéster en secuencias diana específicas. Vienen conservadas en glicerol (el cual previene la congelación a -20 °C, pero que a concentraciones altas puede inhibir la reacción).
• Tampón de reacción: Proporciona las condiciones fisicoquímicas óptimas (pH, fuerza iónica). Generalmente se suministra concentrado a 10x.
• BSA (Albúmina Sérica Bovina): Estabiliza la enzima durante periodos prolongados de incubación.
• Agua estéril libre de nucleasas.
• Factores críticos: Pureza del ADN molde, control estricto de temperatura y pH, ausencia de ADNasas y estabilidad enzimática.

8. Electroforesis de Ácidos Nucleicos

Proceso mediante el cual se separan moléculas cargadas en función de su velocidad de migración en presencia de un campo eléctrico, condicionada por su tamaño molecular y carga neta.

• Carga eléctrica del ADN: Los grupos fosfato otorgan una carga negativa neta homogénea; por ello, al someterse a corriente eléctrica, los fragmentos migran hacia el polo positivo (ánodo).
• Geles de agarosa: Se usan para separar fragmentos estándar. Para discriminar fragmentos de tamaño similar (diferencia de pocas bases) se emplean concentraciones altas de agarosa; si los fragmentos son de gran tamaño, se recurre a porcentajes menores de agarosa.
• Carga de muestras en el gel: El gel debe estar totalmente cubierto con tampón de electroforesis 1x y los pocillos llenos. La muestra se mezcla con tampón de carga (concentrado 6x o 10x) que contiene reactivos densos como sacarosa o glicerol (para depositar la muestra en el fondo) y colorantes marcadores como el azul de bromofenol. Se debe incluir siempre un marcador de peso molecular estándar.
• Visualización y estimación del tamaño: La distancia recorrida por los fragmentos es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Se estima mediante una gráfica semilogarítmica (eje X: distancia recorrida; eje Y: tamaño en pares de bases).
• Geles de poliacrilamida (PAGE): Empleados cuando se requiere una resolución muy alta para separar fragmentos extremadamente pequeños (resolución a nivel de par de bases).

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

1. Fundamento de la Técnica

La PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica enzimática de amplificación in vitro que permite obtener millones de copias idénticas de una región específica del ADN partiendo de una cantidad mínima de molde. Sus variantes permiten amplificar múltiples dianas simultáneas (PCR múltiple), amplificar ARN mediante transcripción inversa previa (RT-PCR) o cuantificar el número de moléculas presentes en tiempo real (qPCR).

2. Bases Teóricas y Componentes de la Reacción

El proceso enzimático catalizado por una ADN polimerasa reproduce la replicación celular. Cada ciclo produce un incremento exponencial de copias. Requiere una enzima que trabaje a temperaturas elevadas sin inactivarse y oligonucleótidos específicos:

• Cebadores (Primers): Oligonucleótidos de cadena sencilla complementarios a las regiones flanqueantes del fragmento diana. Se diseñan por parejas:
  • Cebador Forward (F): Se une a la hebra molde en dirección 3' → 5'.
  • Cebador Reverse (R): Se une a la hebra molde en dirección 5' → 3'.
  • Criterios de diseño: Longitud de 18 a 30 nucleótidos, contenido de G-C equilibrado (40-60 %), ausencia de complementariedades internas u horquillas (hairpins) y temperatura de fusión (T_m) situada entre 52 °C y 65 °C.
• ADN Polimerasas Termoestables: Enzimas capaces de resistir la desnaturalización inicial (a 95-98 °C) e incorporar nucleótidos en dirección 5' → 3' a su temperatura óptima de trabajo (70-75 °C) en presencia de iones Mg²⁺.
  • Tipos según actividad enzimática: Con actividad exonucleasa 5' → 3' pero sin actividad exonucleasa correctora 3' → 5' (no corrigen errores); y enzimas de alta fidelidad con actividad correctora 3' → 5' (tasa de error reducida de aproximadamente un error por millón de bases). Ciertas polimerasas combinan actividad retrotranscriptasa para utilizar ARN molde.
• Tampón de reacción y dNTPs: El tampón suministra el pH y las sales requeridas; los desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) aportan los bloques estructurales (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y energía para la polimerización.
• Cofactores y adyuvantes:
  • Tris-HCl: Mantiene un pH alcalino (~9,0) para estabilizar la mezcla.
  • KCl: Facilita la unión de los cebadores a la cadena molde.
  • MgCl₂: Cofactor esencial de la polimerasa que influye en la fidelidad y la temperatura de anillamiento.
  • Adyuvantes adicionales: DMSO (disminuye la temperatura de desnaturalización en moldes ricos en GC), glicerol (estabiliza la Taq), sulfato de amonio y detergentes no iónicos (evitan la agregación proteica).

3. Ciclo Básico de Amplificación

Una reacción convencional consta de 30 a 40 ciclos sucesivos en un termociclador:

1. Desnaturalización inicial: 95 °C durante 5 a 10 minutos para separar completamente las dos hebras del molde genómico.
2. Ciclo de amplificación repetitivo:
   • Desnaturalización: 95-98 °C (separación de la doble cadena en hebras simples).
   • Hibridación o alineamiento (Annealing): 50-65 °C (los cebadores se unen a sus secuencias complementarias; la temperatura depende de su composición nucleotídica).
   • Extensión o elongación: ~70-72 °C (la ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria añadiendo dNTPs en sentido 5' → 3').
3. Extensión final: 72 °C durante 5 a 10 minutos para asegurar que todos los amplicones incompletos finalicen su elongación.

4. Buenas Prácticas y Limitaciones

Para evitar contaminaciones por arrastre (carry-over) o amplicones previos, se deben establecer áreas de trabajo unidireccionales y separadas físicamente, utilizar material fungible con filtro y reactivos estériles exclusivos para PCR, e incluir sistemáticamente un control negativo (blanco sin molde).

5. Variantes de la Técnica de PCR

• PCR estándar: Amplifica fragmentos inferiores a 3,5 kb; se emplea de rutina en diagnóstico e identificación genética.
• Hot-Start PCR: Mantiene la polimerasa inactiva hasta alcanzar la temperatura inicial de desnaturalización, suprimiendo la formación de dímeros de cebadores y uniones inespecíficas a baja temperatura.
• PCR en Tiempo Real (qPCR cuantitativa): Permite amplificar y cuantificar simultáneamente el producto generado ciclo a ciclo sin recurrir a geles de electroforesis, empleando sistemas fluorescentes:
  • Agentes intercalantes (ej. SYBR Green): Aumentan su fluorescencia al unirse inespecíficamente al ADN de doble cadena.
  • Sondas específicas de hibridación (ej. TaqMan, FRET): Fragmentos de ADN marcados con fluorocromos donador (en extremo 5') y aceptor/represor (en extremo 3').
  • Aplicaciones: Cuantificación absoluta y relativa de carga viral o expresión génica, y detección de polimorfismos o mutaciones mediante curvas de fusión (melting curves).
• Limitación de la PCR convencional frente a la qPCR: En la PCR estándar, la cuantificación del ADN original es imprecisa debido a que, tras una fase de crecimiento exponencial, la reacción entra en una fase de meseta o saturación por agotamiento de reactivos e inactivación de la enzima, momento en el que el producto final no refleja la cantidad inicial de molde.