Técnicas de Preparación y Tinción de Muestras para Microscopía

Preparación de Especímenes en Fresco

Es la forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico. Existen dos técnicas:

• Preparación en fresco simple: Se coloca una gota de medio líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos.
• Preparación en gota pendiente: Se coloca una gota del material en un cubreobjetos y se cubre con un portaobjetos excavado invertido. Se sella después la preparación con vaselina.

La ventaja de esta técnica es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo. El inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación, aunque existen colorantes que se pueden usar en muestras vivas.

Fijación y Tinción de Muestras

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. Salvo los colorantes vitales, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, muertos y adheridos al portaobjetos. Esta fijación posee algunos inconvenientes: a menudo distorsionan la apariencia real de las células, dificultando la identificación. Además, no permite la observación del movimiento de los microorganismos.

La fijación se puede hacer por calor o químicamente:

• Fijación por calor: Se hace un frotis (extensión fina) de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos, se deja secar al aire, luego se pasa la preparación de forma rápida sobre la llama de un mechero. El calor de la llama mata las células microbianas y las une al portaobjetos.
• Fijación química: Se utiliza cuando se desea fijar especímenes delicados, ya que es menos agresiva que el calor. Para ello, se añade una gota de un fijador sobre la muestra líquida con los microorganismos.

Después de la fijación, se añade el colorante y se deja actuar el tiempo suficiente para que sea absorbido. A continuación, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua destilada.

Tipos de Tinciones

Existen tres tipos de tinciones:

• Tinción simple: Utiliza un único colorante con el único objetivo de incrementar el contraste. Todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple solo mejorará la observación de la célula completa, pero no permite distinguir entre partes de la misma célula ni entre distintas células. Se realiza el frotis y la fijación, se añade el colorante dejando el tiempo necesario para que se absorba, se retira el exceso de colorante, se seca y ya está lista la preparación.
• Tinción diferencial: Se utiliza para distinguir entre tipos distintos de microorganismos. Consta de dos etapas: tinción primaria (como una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En esta se utiliza otro colorante de color más claro que tiñe y, por tanto, revela las células no teñidas por el primer colorante.
• Tinción estructural: Permite teñir específicamente estructuras particulares de los microorganismos, como pueden ser las endosporas, los flagelos y las cápsulas.