Técnicas y pruebas genéticas en Medicina

PCR/OLA

Técnica dirigida para saber qué base está mutada en un gen concreto. Para saber si el genotipo es silvestre o mutante, se amplifica el fragmento por PCR, ejemplo T es silvestre y G es mutado. Se diseña un oligonucleótido (OLA) complementario a la cadena, asociado con el marcador biotina y se diseña otro oligo asociado al marcador desoxigenina complementario al resto de la cadena. Cuando se tiene las copias del genoma amplificado x PCR se añade el exceso de oligo y una ligasa que unirá a ambos si están apareados siendo el paciente silvestre. Se desnaturaliza el ADN y se añade a un pocillo de plástico recubierto con estreptavidina que se asocia con la biotina y esta estará unida al oligo de desoxigenina. Se añade un anticuerpo antidesoxigenina acoplado a la enzima fosfatasa alcalina y se añade un sustrato incoloro que convierte la fosfatasa en un sustrato coloreado (así sabemos que el gen es silvestre). Si no hay ligación el anticuerpo no se podrá unir a nada y no se podrá poner de color.

Promotor de la lactosa

El promotor interactúa con el sistema de expresión génica, tiene una alta afinidad con la ARN polimerasa provocando que una región de transcriba. En este caso, interacciona con proteínas reguladoras que controlan la transcripción de genes adyacentes clonados. En ausencia de lactosa en el medio de crecimiento el promotor Lac es reprimido por la unión de un represor de la lactosa y se evita la transcripción. La activación del promotor Lac se induce añadiendo al medio lactosa o IPTG que es un inductor. Para que haya mayor traducción, el promotor lac es regulado por la proteína CAP que se une a la región llamada caja CAP del ADN y se activa cuando tiene AMPc que se encuentra a altos niveles cuando la concentración de glucosa es baja. POCA GLUCOSA, ALTA LACTOSA.

Ratón Knock Out/KO

Se cogen células madre embrionarias de cara interna del blastocito, se mete el transgén donde se sustituye parte del ADN genómico por externo, buscando la eliminación selectiva del gen que nos interesa. Se seleccionan los recombinantes y se meten en el blastocito. Este pasa a una ratona adoptiva dando un organismo quimérico con tejidos que vienen del blastocito original y tejidos formados por lo que hemos introducido.

Sondas con candado

Técnica para saber qué sitio está mutado exactamente. Al ADN dentro de un pocillo de plástico se le añade una sonda con un marcador, que va a hibridar con el ADN. Luego, se añade una ligasa que ligará si está apareado. Después se lava la muestra para eliminar las bases que no se encuentran ligadas perfectamente. Así, se ve si la muestra lleva el marcador que se ha puesto a la sonda y con qué relaciona ese marcador.

Test citogenéticos

Test que permite identificar mutaciones de gran tamaño, se miran los cromosomas. Técnica FISH por la que se coge una sonda que se marca, hibrida con la muestra y muestra los lugares con “problemas”. Así se puede identificar por ejemplo el síndrome de DiGeorge, daño en el cromosoma 22.

Test genéticos

Basados en el ácido nucleico como herramienta. Detectan la presencia de variantes en un gen que conduce a la ausencia o funcionamiento anómalo de una proteína. Fenilcetonuria (Si falta Phe hidroxilasa la Phe que pasa a tirosina en condiciones normales, con la falta se acumulará Phe debido a una mutación en un gen autosómico recesivo. Se emplea el test de Guthrie para detectarlo, detecta elevados niveles de Phe en sangre, basado en la capacidad de Phe para facilitar el crecimiento bacteria en un medio con inhibidor de crecimiento, punción en el talón de bebé pocos días de nacer y ve sangre si crece con el inhibidor y una bacteria.

Utilidad test genéticos

Ventajas (cantidad mínima de muestra, elevada especificidad analítica, elevada sensibilidad al poder obtener mayor cantidad de ADN o ARN por PCR, rapidez frente a otros métodos clásicos, a veces única técnica posible), Desventajas (requiere conocimiento especializado, técnicas complejas, verificación de la utilidad de dianas, equipamiento más sofisticado, necesidad de áreas físicamente separadas).

Vehículo de transferencia

Son los encargados de asegurar la estabilidad del material genético transportado y vencer barreras biológicas para alcanzar el núcleo de la célula diana. Barreras que presenta integración gen (estabilidad del medio extracelular, reconocimiento diana concreta, unión a membrana, internalización, escape de sistemas de degradación como lisosomas, entrada al núcleo).