Técnicas de tipificación HLA: RFLP, PCR-SSP, PCR-SSOP, Luminex y SBT

Técnicas de tipificación HLA

Técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

Primer método que se utilizó. Se basa en la capacidad que tienen las enzimas de restricción para reconocer determinadas secuencias de nucleótidos y cortar el ADN en los sitios de restricción, y en la posterior visualización de esos fragmentos tras realizar una electroforesis en geles de acrilamida.

• Principio: corte por enzimas de restricción según secuencias específicas.
• Visualización: electroforesis en geles de acrilamida.
• Uso histórico: primer método empleado para detectar polimorfismos en longitud de fragmentos.

PCR-SSP (Sequence Specific Priming o cebadores específicos de secuencia)

Requiere diversas reacciones de amplificación para cada locus; en cada una de ellas se usa un conjunto de cebadores cuyas secuencias discriminan las diferentes variantes que puede presentar el locus. Los cebadores no complementarios no se unen y no generan productos de amplificación. La presencia de los productos amplificados se detecta mediante electroforesis en gel de agarosa, donde aparecen como bandas.

• Ventaja: especificidad para variantes alélicas concretas.
• Limitación: se necesitan reacciones múltiples por locus.

PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide o sondas de oligonucleótidos de secuencia específica)

Consiste en una PCR con cebadores específicos de locus seguida de hibridación con sondas marcadas específicas de alelos, adecuada para un elevado número de muestras. Se realiza la amplificación por PCR de múltiples alelos diferentes del HLA y su hibridación posterior con sondas específicas marcadas, previamente inmovilizadas en una membrana de nailon.

• Aplicación: tipificación en serie de muchas muestras.
• Soporte: sondas inmovilizadas en membrana de nailon para posterior detección.

Luminex o ensayo de fase sólida

Es una variante de PCR-SSOP que permite el tipaje de alta resolución de manera rápida. Las sondas están acopladas covalentemente a un conjunto de microesferas marcadas con dos fluorocromos. La hibridación se realiza en un tubo en el que las perlas unidas a sondas específicas hibridan con el alelo específico en caso de estar presente. La lectura se realiza por citometría de flujo.

• Característica clave: microesferas codificadas con fluorocromos que permiten multiplexado.
• Lectura: citometría de flujo para identificar sondas positivas.

SBT (Sequence Based Typing o tipaje basado en la secuenciación)

Esta técnica se basa en la amplificación de la región HLA de estudio seguida de la secuenciación directa del producto de PCR. Es un método de alta resolución y resulta especialmente importante en casos de trasplante de médula ósea. Se trata de una tipificación basada en la secuenciación.

• Ventaja: resolución alélica alta mediante lectura directa de la secuencia.
• Importancia clínica: relevante en trasplantes y situaciones que requieren alta precisión en el tipaje.