Técnicas de tipificación HLA: RFLP, PCR-SSP, PCR-SSOP, Luminex y SBT

Resumen

El documento describe las principales técnicas de tipificación HLA, desde el método pionero RFLP hasta métodos de alta resolución como Luminex y SBT. Explica el principio de cada técnica, cómo se detectan los productos y sus ventajas y limitaciones. Un estudiante aprenderá a distinguir qué método conviene según el número de muestras y el nivel de resolución requerido.

Puntos clave

RFLP: utiliza enzimas de restricción que cortan el ADN según secuencias específicas y los fragmentos se visualizan por electroforesis en geles de acrilamida; fue el primer método empleado.
PCR-SSP: emplea cebadores específicos de secuencia; requiere varias reacciones de amplificación por locus y los productos se detectan como bandas en gel de agarosa.
PCR-SSOP: amplificación por PCR seguida de hibridación con sondas específicas de alelos inmovilizadas en membrana de nailon; adecuada para un gran número de muestras.
Luminex (ensayo de fase sólida): variante de PCR-SSOP con sondas acopladas a microesferas marcadas con dos fluorocromos, lectura por citometría de flujo y tipaje de alta resolución rápido.
SBT: amplificación de la región HLA seguida de secuenciación directa del producto de PCR; método de alta resolución, especialmente importante en trasplante de médula ósea.

Ponte a prueba

Técnicas de tipificación HLA

Técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

Primer método que se utilizó. Se basa en la capacidad que tienen las enzimas de restricción para reconocer determinadas secuencias de nucleótidos y cortar el ADN en los sitios de restricción, y en la posterior visualización de esos fragmentos tras realizar una electroforesis en geles de acrilamida.

Principio: corte por enzimas de restricción según secuencias específicas.
Visualización: electroforesis en geles de acrilamida.
Uso histórico: primer método empleado para detectar polimorfismos en longitud de fragmentos.

PCR-SSP (Sequence Specific Priming o cebadores específicos de secuencia)

Requiere diversas reacciones de amplificación para cada locus; en cada una de ellas se usa un conjunto de cebadores cuyas secuencias discriminan las diferentes variantes que puede presentar el locus. Los cebadores no complementarios no se unen y no generan productos de amplificación. La presencia de los productos amplificados se detecta mediante electroforesis en gel de agarosa, donde aparecen como bandas.

Ventaja: especificidad para variantes alélicas concretas.
Limitación: se necesitan reacciones múltiples por locus.

PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide o sondas de oligonucleótidos de secuencia específica)

Consiste en una PCR con cebadores específicos de locus seguida de hibridación con sondas marcadas específicas de alelos, adecuada para un elevado número de muestras. Se realiza la amplificación por PCR de múltiples alelos diferentes del HLA y su hibridación posterior con sondas específicas marcadas, previamente inmovilizadas en una membrana de nailon.

Aplicación: tipificación en serie de muchas muestras.
Soporte: sondas inmovilizadas en membrana de nailon para posterior detección.

Luminex o ensayo de fase sólida

Es una variante de PCR-SSOP que permite el tipaje de alta resolución de manera rápida. Las sondas están acopladas covalentemente a un conjunto de microesferas marcadas con dos fluorocromos. La hibridación se realiza en un tubo en el que las perlas unidas a sondas específicas hibridan con el alelo específico en caso de estar presente. La lectura se realiza por citometría de flujo.

Característica clave: microesferas codificadas con fluorocromos que permiten multiplexado.
Lectura: citometría de flujo para identificar sondas positivas.

SBT (Sequence Based Typing o tipaje basado en la secuenciación)

Esta técnica se basa en la amplificación de la región HLA de estudio seguida de la secuenciación directa del producto de PCR. Es un método de alta resolución y resulta especialmente importante en casos de trasplante de médula ósea. Se trata de una tipificación basada en la secuenciación.

Ventaja: resolución alélica alta mediante lectura directa de la secuencia.
Importancia clínica: relevante en trasplantes y situaciones que requieren alta precisión en el tipaje.

Preguntas frecuentes

¿En qué se basa la técnica RFLP para la tipificación HLA?

Se basa en la capacidad de las enzimas de restricción para reconocer secuencias específicas de nucleótidos y cortar el ADN en esos sitios. Los fragmentos resultantes se visualizan mediante electroforesis en geles de acrilamida.

¿Cuál es la diferencia entre PCR-SSP y PCR-SSOP?

La PCR-SSP usa cebadores específicos de secuencia y detecta los productos amplificados en gel de agarosa, requiriendo varias reacciones por locus. La PCR-SSOP amplifica por PCR con cebadores específicos de locus y después hibrida con sondas marcadas específicas de alelos, adecuada para muchas muestras.

¿Por qué es importante el método SBT en el trasplante de médula ósea?

Es un método de alta resolución que se basa en la secuenciación directa del producto de PCR, lo que lo hace especialmente importante en casos de trasplante de médula ósea.