Tipaje molecular HLA: técnicas PCR, RFLP, Luminex y secuenciación para tipificación

Técnicas de tipaje molecular

Los métodos de biología molecular no determinan los antígenos (Ag), sino los genes que dan lugar a los mismos. Se realizan con métodos diferentes y todos ellos requieren un paso inicial de amplificación del ADN, que previamente ha sido extraído de una muestra de sangre periférica con EDTA. Se basan en la realización de una PCR.

1. Técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

RFLP: Se basa en la capacidad que tienen las enzimas de restricción para reconocer determinadas secuencias de nucleótidos y cortar el ADN en los sitios de restricción. Se pueden visualizar esos fragmentos tras realizar una electroforesis en geles de acrilamida.

2. PCR-SSP (cebadores específicos de secuencia)

PCR-SSP: Requiere diversas reacciones de amplificación para cada locus y, en cada una de ellas, se usa un conjunto de cebadores cuyas secuencias discriminan las diferentes variantes que puede presentar el locus. Los cebadores no complementarios no se unirán y no generarán productos de amplificación. A continuación, se comprueba mediante electroforesis en gel de agarosa la existencia o no de los productos amplificados, que aparecen como bandas en el gel.

3. PCR-SSOP (sondas de oligonucleótidos de secuencia específica)

PCR-SSOP: PCR con cebadores específicos de locus e hibridación con sondas marcadas y específicas de alelos. Es el método de elección para un elevado número de muestras. Consiste en la amplificación de múltiples alelos diferentes del HLA y su hibridación posterior con sondas específicas (SSO) marcadas, previamente inmovilizadas en una membrana de nailon.

4. Luminex o ensayo de fase sólida

Luminex: PCR-SSOP que permite el estudio de alta resolución de manera rápida. Las sondas están acopladas covalentemente a un conjunto de microesferas marcadas con dos fluorocromos. La hibridación se realiza en un tubo en el que las perlas unidas a sondas específicas se hibridarán con el alelo específico en caso de estar presente. El conjunto se analiza por citometría de flujo. Presenta un alto grado de automatización.

5. SBT (tipaje basado en la secuenciación)

SBT: Se basa en la amplificación de la región HLA de estudio con la secuenciación directa del producto de PCR. Es un método de tipaje de alta resolución y resulta importante en casos de trasplante de médula ósea. Se trata de una tipificación basada en la secuenciación.

Consideraciones finales

• Cada técnica tiene aplicaciones específicas según el número de muestras, la resolución requerida y el grado de automatización necesario.
• La correcta extracción del ADN y la elección de la metodología influyen directamente en la fiabilidad del tipaje.