Técnicas de tipaje molecular HLA: RFLP, PCR-SSP, PCR-SSOP, Luminex y SBT

Resumen

El documento explica los métodos de biología molecular empleados para el tipaje HLA, que determinan los genes que codifican los antígenos y no los antígenos en sí. Describe las técnicas RFLP, PCR-SSP, PCR-SSOP, Luminex y SBT, indicando su principio, su aplicación y su grado de resolución. Un estudiante aprenderá a diferenciar estos métodos según el número de muestras y la resolución requerida.

Puntos clave

Los métodos de biología molecular tipan los genes HLA, no los antígenos directamente.
Todas las técnicas requieren una amplificación previa del ADN extraído de sangre periférica con EDTA, mediante PCR.
RFLP usa enzimas de restricción que cortan el ADN en secuencias concretas y los fragmentos se visualizan por electroforesis en gel de acrilamida.
PCR-SSP utiliza cebadores específicos de secuencia y la presencia de bandas en gel de agarosa indica los alelos amplificados.
PCR-SSOP combina amplificación con cebadores específicos de locus e hibridación con sondas alelo-específicas, siendo el método de elección para muchas muestras.
Luminex es un PCR-SSOP de alta resolución y rápido, con sondas unidas a microesferas analizadas por citometría de flujo y alto grado de automatización.
SBT se basa en la secuenciación directa del producto de PCR, ofrece alta resolución y es importante en trasplante de médula ósea.

Ponte a prueba

Técnicas de tipaje molecular

Los métodos de biología molecular no determinan los antígenos (Ag), sino los genes que dan lugar a los mismos. Se realizan con métodos diferentes y todos ellos requieren un paso inicial de amplificación del ADN, que previamente ha sido extraído de una muestra de sangre periférica con EDTA. Se basan en la realización de una PCR.

1. Técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)

RFLP: Se basa en la capacidad que tienen las enzimas de restricción para reconocer determinadas secuencias de nucleótidos y cortar el ADN en los sitios de restricción. Se pueden visualizar esos fragmentos tras realizar una electroforesis en geles de acrilamida.

2. PCR-SSP (cebadores específicos de secuencia)

PCR-SSP: Requiere diversas reacciones de amplificación para cada locus y, en cada una de ellas, se usa un conjunto de cebadores cuyas secuencias discriminan las diferentes variantes que puede presentar el locus. Los cebadores no complementarios no se unirán y no generarán productos de amplificación. A continuación, se comprueba mediante electroforesis en gel de agarosa la existencia o no de los productos amplificados, que aparecen como bandas en el gel.

3. PCR-SSOP (sondas de oligonucleótidos de secuencia específica)

PCR-SSOP: PCR con cebadores específicos de locus e hibridación con sondas marcadas y específicas de alelos. Es el método de elección para un elevado número de muestras. Consiste en la amplificación de múltiples alelos diferentes del HLA y su hibridación posterior con sondas específicas (SSO) marcadas, previamente inmovilizadas en una membrana de nailon.

4. Luminex o ensayo de fase sólida

Luminex: PCR-SSOP que permite el estudio de alta resolución de manera rápida. Las sondas están acopladas covalentemente a un conjunto de microesferas marcadas con dos fluorocromos. La hibridación se realiza en un tubo en el que las perlas unidas a sondas específicas se hibridarán con el alelo específico en caso de estar presente. El conjunto se analiza por citometría de flujo. Presenta un alto grado de automatización.

5. SBT (tipaje basado en la secuenciación)

SBT: Se basa en la amplificación de la región HLA de estudio con la secuenciación directa del producto de PCR. Es un método de tipaje de alta resolución y resulta importante en casos de trasplante de médula ósea. Se trata de una tipificación basada en la secuenciación.

Consideraciones finales

Cada técnica tiene aplicaciones específicas según el número de muestras, la resolución requerida y el grado de automatización necesario.
La correcta extracción del ADN y la elección de la metodología influyen directamente en la fiabilidad del tipaje.

Preguntas frecuentes

¿Qué determinan los métodos de tipaje molecular HLA?

Los métodos de biología molecular no determinan directamente los antígenos, sino los genes que dan lugar a los mismos. Todos requieren una amplificación de ADN mediante PCR.

¿En qué consiste la técnica PCR-SSOP?

Consiste en amplificar múltiples alelos del HLA con cebadores específicos de locus e hibridarlos con sondas específicas de alelo (SSO) inmovilizadas en una membrana de nailon. Es el método de elección para un elevado número de muestras.

¿Cuál es la principal ventaja de la técnica Luminex?

Permite un estudio de alta resolución de manera rápida, con sondas acopladas a microesferas marcadas que se analizan por citometría de flujo. Además, presenta un alto grado de automatización.

¿Para qué casos es importante la técnica SBT?

Es un método de tipaje de alta resolución basado en la secuenciación directa del producto de PCR. Resulta especialmente importante en casos de trasplante de médula ósea.