Tipos de microscopios en histología: características, funcionamiento y aplicaciones
Microscopio estereoscópico, simple o lupa
Definición: está compuesto por una lente o un sistema de lentes convergentes biconvexas, sostenidas por una estructura mecánica con soporte y tornillos de enfoque.
Características importantes:
- Proporciona aumentos de 2 a 30 veces (2–30X).
- En histología se utiliza para diseccionar piezas anatómicas pequeñas.
- Permite orientar correctamente la pieza antes de su procesamiento.
- Ejemplo: la observación del pez cebra durante su desarrollo embrionario.
Para memorizar: lupa, aumento de 2–30X, disección y orientación de piezas pequeñas.
Microscopio óptico convencional o de campo claro
Definición: es un instrumento mecánico capaz de modular la energía luminosa y ampliar la resolución de la visión humana, produciendo imágenes aumentadas. Su funcionamiento depende de dos sistemas: el óptico y el mecánico.
1. Sistema óptico
- Ocular: lente próxima al observador; recoge la imagen formada por el objetivo y genera otra imagen aumentada y virtual.
- Objetivo: lente próxima a la muestra. Los aumentos indicados en el PDF son habitualmente 2,5–5X, 10X, 25X, 40–45X y 100X (inmersión).
- Iluminación: está debajo de la platina e incluye fuente de luz, espejo, filtros, lente colectora y diafragma.
- Condensador: concentra los rayos de luz y los dirige hacia el orificio de la platina.
- Diafragma: regula la cantidad de luz que llega a la muestra. Para muestras no teñidas, cerrar el paso de luz aumenta el contraste.
2. Sistema mecánico
- Pie: sostiene toda la estructura.
- Tubo: contiene los oculares y el revólver con los objetivos.
- Platina: superficie donde se coloca la preparación; se desplaza hacia los lados y hacia delante y atrás.
- Tornillo macrométrico: enfoque grueso.
- Tornillo micrométrico: enfoque fino.
Para memorizar: distingue el sistema óptico (lentes e iluminación) del mecánico (soporte, platina y enfoque).
Microscopio de campo oscuro
Definición: utiliza un condensador especial que dirige los rayos luminosos lateralmente e ilumina la muestra de forma oblicua.
¿Para qué sirve?
- Se utiliza para observar células vivas y móviles, como bacterias o espermatozoides.
- Permite distinguir estructuras que destacan sobre un fondo oscuro, como el nucléolo, las mitocondrias, la envoltura celular y las gotas de lípidos en células cultivadas.
Para memorizar: iluminación oblicua, fondo oscuro, células vivas y móviles.
Microscopio de contraste de fases
Definición: aprovecha el retraso que experimentan los rayos luminosos al atravesar estructuras celulares con diferentes índices de refracción. Amplifica esas diferencias para convertirlas en contrastes visibles en distintos tonos de gris.
Características importantes:
- Las estructuras más densas se observan más oscuras.
- Las estructuras más laxas se observan más claras.
- Se utiliza para estudiar células vivas.
Microscopio de interferencia, Nomarski o DIC
Definición: es una modificación del microscopio de contraste de fases. Su sistema óptico utiliza prismas birrefringentes y un polarizador para dividir la luz en dos haces: uno atraviesa la muestra y el otro pasa lateralmente. Después, ambos haces vuelven a interferir.
Características importantes:
- Produce imágenes de alto contraste y un efecto característico de bajo relieve.
- El contraste depende de los índices de refracción de los componentes de la muestra.
- Permite observar especímenes transparentes y sin colorear.
- Proporciona información sobre la densidad óptica y permite trabajar con muestras de mayor grosor.
Para memorizar: dos haces de luz, prismas birrefringentes, alto contraste y muestras transparentes sin teñir.
Microscopio invertido
Definición: se caracteriza porque el revólver con los objetivos está debajo de la platina, mientras que el sistema de iluminación y el condensador se encuentran por encima.
Características importantes:
- Puede incorporar un control manual para manipular gametos o embriones.
- Puede incorporar una lámpara de fluorescencia y filtros de excitación.
- Se emplea habitualmente para observar mediante contraste de fases o de interferencia.
- Es típico para manipular gametos y embriones vivos in vivo en técnicas de fecundación.
Para memorizar: objetivos debajo de la platina y manipulación de gametos o embriones vivos.
Microscopio de fluorescencia
Definición: detecta moléculas fluorescentes que absorben luz de una longitud de onda determinada y después emiten luz de una longitud de onda mayor.
Partes y funcionamiento
- Fuente de luz ultravioleta: proporciona la luz para excitar las moléculas fluorescentes.
- Filtro de excitación: deja pasar únicamente la longitud de onda que excita las moléculas.
- Filtro de emisión: deja pasar la longitud de onda reemitida por las moléculas fluorescentes.
- Espejo dicroico: refleja la luz de excitación y permite el paso de la luz reemitida.
Estos elementos se encuentran en un cubo de filtros.
¿Qué permite observar?
- Fluorescencia natural, como la de la clorofila.
- Fluorescencia inducida mediante colorantes fluorescentes o fluorocromos.
- Pueden utilizarse anticuerpos unidos a fluorocromos que se añaden a la preparación.
- Los dos fluorocromos destacados en el PDF son fluoresceína y rodamina.
- En las diapositivas se muestra un ejemplo de detección de leucemia mieloide crónica.
Para memorizar: excitación y emisión, espejo dicroico, cubo de filtros, fluoresceína y rodamina.
Microscopio confocal
Definición: es un tipo de microscopio de fluorescencia adaptado para observar las muestras con mayor resolución y definición.
Características importantes:
- Utiliza una fuente de luz láser monocromática.
- Tiene diafragmas llamados pinhole, situados en los filtros de excitación y emisión.
- Posee un sistema fotomultiplicador que detecta la fluorescencia.
- La señal se transforma en una imagen visible mediante un sistema informático.
- El sistema recoge información de distintos planos de la muestra, llamados cortes ópticos seriados en Z.
- Estos planos permiten reconstruir la muestra en tres dimensiones (3D).
Para memorizar: láser, pinhole, fotomultiplicador, cortes ópticos en Z y reconstrucción 3D.
Microscopía electrónica
Definición: permite observar estructuras y componentes intracelulares con un poder de resolución superior al de los demás tipos de microscopios descritos en el PDF. Utiliza electrones en lugar de un haz de luz.
Tipos que aparecen en el tema:
- TEM: microscopio electrónico de transmisión.
- SEM: microscopio electrónico de barrido.
Para memorizar: electrones, mayor poder de resolución y dos tipos: TEM y SEM.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Definición: utiliza un tubo que genera radiación de electrones y bobinas electromagnéticas. Los electrones se desplazan en línea recta dentro del vacío y las bobinas los desvían, funcionando de forma comparable a las lentes de un microscopio óptico.
Características importantes:
- La bobina colectora equivale aproximadamente al objetivo.
- La bobina condensadora equivale aproximadamente al condensador.
- Cuando los electrones llegan a una pantalla fluorescente, se obtiene la imagen de la muestra.
- Las zonas más oscuras corresponden a mayor dispersión de electrones y mayor densidad.
- Puede alcanzar aumentos de 200.000X o hasta un millón, suficientes para visualizar muchas macromoléculas biológicas.
- Para observar las muestras se utilizan rejillas de níquel o cobre, porque los electrones no pueden atravesar el vidrio de los portaobjetos convencionales.
Para memorizar: los electrones atraviesan una muestra muy fina; permite estudiar estructuras internas, genera imágenes con zonas claras y oscuras y utiliza rejillas de níquel o cobre.
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Definición: permite observar la superficie de especímenes gruesos e incluso organismos enteros, previamente fijados y metalizados.
Características importantes:
- El haz de electrones no atraviesa la muestra: realiza un barrido por toda su superficie.
- Durante el barrido se producen distintos electrones, entre ellos los secundarios.
- Un detector capta estos electrones y la información se proyecta en la pantalla.
- La muestra se recubre con una capa molecular de metal, como oro-paladio, mediante un proceso llamado metalización.
- La imagen depende del grado y la dirección de dispersión de los electrones secundarios, que varían según la geometría de la muestra.
- La imagen final tiene apariencia tridimensional (3D) y gran poder de resolución.
Para memorizar: observa superficies, no atraviesa la muestra, necesita metalización con oro-paladio y produce imágenes con apariencia 3D.