Estabilitat dels Àcids Nucleics i Components de la PCR

Factors que afecten l'estabilitat dels àcids nucleics

• Nombre de parells GC respecte dels parells AT: a major nombre d'enllaços d'hidrogen entre els filaments, major estabilitat dels híbrids (3 enllaços d'H entre G i C, 2 enllaços d'hidrogen entre A i T).
• Grau de complementarietat: a menor complementarietat de bases, menys enllaços d'hidrogen formats i, per tant, menor estabilitat.
• Longitud dels filaments: a major longitud dels filaments, més enllaços d'hidrogen, més interaccions hidrofòbiques entre les bases i major estabilitat de l'híbrid.
• Concentració de sal en la solució: ↑ [sal] → ↑ estabilitat de l'híbrid. Les càrregues negatives dels grups fosfat es repel·leixen unes a altres. Els ions positius en solució redueixen la repulsió electrostàtica entre els filaments, tant els cations monovalents (Na⁺) com els divalents (Mg²⁺).
• Temperatura: la temperatura ha de ser prou alta per trencar els ponts d'hidrogen formats entre diferents bases d'un filament monocatenari i prou baixa perquè es formin els ponts entre filaments diferents. Es representa per Tm la temperatura de separació dels filaments (melting temperature) i és una mesura de l'estabilitat dels híbrids.
• Agents desnaturalitzants: com la formamida i la urea, desestabilitzen l'híbrid.

Components de la PCR

En la PCR podem diferenciar els següents components:

• Tampó: buffer d'amplificació. Els més utilitzats contenen KCl, Tris i MgCl₂. Aquest últim és essencial per a l'activitat de la Taq polimerasa, ja que el Mg²⁺ actua com a cofactor d'aquesta. No obstant això, cal anar amb compte amb les quantitats de Mg, ja que un excés d'aquest donarà lloc a productes inespecífics.
• Primers o encebadors: han de ser complementaris a cada un dels extrems 3' de la regió que volem amplificar i són necessaris per a l'activitat de la polimerasa.
• Desoxinucleòtids trifosfat (dNTPs): són necessaris perquè la polimerasa els utilitzi com a substrat i pugui dur a terme la reacció d'amplificació. S'afegeixen els quatre tipus de dNTPs que componen l'ADN en una barreja equimolar.
• Polimerasa: enzim resistent a les altes temperatures a les quals anem a sotmetre el nostre tub de reacció. És una polimerasa aïllada de bacteris termoresistents.
• ADN mostra: ADN que volem amplificar.