De Werking en Toepassingen van PCR: Van DNA-kopie tot Forensisch Bewijs

Wat is PCR (Polymerase Chain Reaction)?

PCR (Polymerase Chain Reaction) is een techniek waarmee een klein stukje DNA in het laboratorium miljoenen tot miljarden keren wordt gekopieerd. Dit is essentieel omdat onderzoekers vaak over slechts een minimale hoeveelheid DNA beschikken, zoals bij bloedsporen, haar, speeksel of foetaal materiaal. Een enkel haar op een plaats delict bevat bijvoorbeeld te weinig DNA voor direct onderzoek, maar dankzij PCR kunnen er voldoende kopieën worden gemaakt voor een nauwkeurige identificatie.

Natuurlijke DNA-vermenigvuldiging

Bij een celdeling wordt het DNA verdubbeld. Dit proces verloopt in verschillende fasen:

• Eerst worden de H-bruggen tussen de basen verbroken, zodat de twee DNA-strengen van elkaar scheiden.
• Daarna hechten primers zich aan het DNA.
• Vervolgens bouwt DNA-polymerase een nieuwe streng op volgens de vaste basenparing: Adenine (A) met Thymine (T) en Cytosine (C) met Guanine (G).

Verschillen tussen natuurlijke DNA-vermenigvuldiging en PCR

Hoewel PCR het natuurlijke proces nabootst, zijn er enkele cruciale verschillen:

• Opening van het DNA: In de natuur opent het enzym helicase het DNA; bij PCR gebeurt dit door verhitting.
• Primers: In de natuur maakt het enzym primase de primers; bij PCR voegen onderzoekers specifiek ontworpen primers toe.
• Verlenging: In de natuur verlengt DNA-polymerase de streng; bij PCR wordt hiervoor Taq-polymerase gebruikt.
• Ligase: Dit enzym is bij PCR niet nodig.

Waarom gebruikt men Taq-polymerase?

Tijdens het PCR-proces wordt het DNA herhaaldelijk verwarmd tot 90–95°C om de strengen te scheiden. Een standaard DNA-polymerase zou bij deze temperaturen denatureren (kapotgaan). Daarom maken onderzoekers gebruik van Taq-polymerase, afkomstig van de bacterie Thermus aquaticus, die in warmwaterbronnen leeft. Het enzym van deze bacterie blijft werken bij hoge temperaturen en kan daardoor na elke verwarmingsstap opnieuw DNA opbouwen.

De drie stappen van de PCR-cyclus

Een PCR-proces verloopt in drie opeenvolgende stappen:

1. Denaturatie: De DNA-strengen worden door verhitting van elkaar gescheiden.
2. Hybridisatie: De primers hechten zich aan het gewenste DNA-fragment.
3. Ketenextensie: Taq-polymerase bouwt de nieuwe DNA-strengen op.

Na elke cyclus verdubbelt het aantal DNA-fragmenten. Na ongeveer 30 cycli zijn er meer dan een miljard kopieën aanwezig.

Kary Mullis: De uitvinder

De PCR-techniek werd in 1983 ontwikkeld door Kary Mullis. Voor deze revolutionaire uitvinding ontving hij in 1993 de Nobelprijs.

Toepassingen van PCR

Forensisch onderzoek

PCR wordt gebruikt om DNA uit bewijsmateriaal zoals bloed, speeksel, haar, sperma of huidschilfers te vergelijken met dat van verdachten. Een speekselspoor op een glas kan bijvoorbeeld worden gelinkt aan een specifiek persoon. Dankzij DNA-profielen kunnen daders nauwkeurig worden geïdentificeerd. Ook slachtoffers van zware ongevallen kunnen via DNA-vergelijking met familieleden worden geïdentificeerd.

Orgaantransplantaties

Bij transplantaties wordt het HLA-complex (Human Leucocyte Antigen) van de donor en de ontvanger vergeleken. Hoe groter de overeenkomst, hoe kleiner de kans dat het lichaam het nieuwe orgaan afstoot.

Opsporen van ziekteverwekkers

Bacteriën, schimmels en virussen bezitten uniek erfelijk materiaal. PCR kan deze ziekteverwekkers detecteren, zelfs wanneer ze slechts in zeer kleine hoeveelheden aanwezig zijn.

Corona als voorbeeld

Bij een coronatest wordt een neus- of keelstaal afgenomen. De PCR-test zoekt naar het genetisch materiaal van het coronavirus. Indien aanwezig, wordt dit miljoenen keren gekopieerd, waardoor een besmetting kan worden aangetoond, zelfs wanneer er nog weinig virus aanwezig is.

HIV-detectie

PCR kan het HIV-virus zelf direct opsporen. Klassieke tests zoeken meestal naar antistoffen, maar het kan weken of maanden duren voordat deze gevormd zijn. Een PCR-test kan dus al positief zijn terwijl een klassieke test nog negatief uitvalt. Bij baby's van HIV-positieve moeders kan PCR aantonen of het kind zelf besmet is, ook al heeft het antistoffen van de moeder gekregen.

Tuberculose

PCR versnelt de detectie van tuberculose aanzienlijk in vergelijking met traditionele bacteriekweken. Dit leidt tot een snellere diagnose en voorkomt onnodige behandelingen.

Evolutieonderzoek

PCR wordt gebruikt om DNA van oude organismen te onderzoeken. Zo bleek uit onderzoek dat de mammoet een nauwe verwant van de olifant was. DNA-onderzoek van oude menselijke resten biedt bovendien informatie over de oorsprong en migratie van bevolkingsgroepen.

Mitochondriaal DNA (mtDNA)

In mitochondriën zit eigen DNA, het mitochondriaal DNA of mtDNA. Dit wordt uitsluitend via de moeder doorgegeven. Daarom is mtDNA zeer nuttig voor verwantschapsonderzoek en onderzoek naar de oorsprong van de mens. Met mtDNA kon men aantonen dat de oorsprong van de mens waarschijnlijk in Oost-Afrika ligt. Ook de identificatie van Nicholas II en zijn familie gebeurde met behulp van mtDNA-analyse.

Elektroforese en DNA-fingerprinting

Wat is elektroforese?

Elektroforese betekent migratie in een elektrisch veld. Omdat DNA negatief geladen is, beweegt het naar de positieve pool (de anode). Wanneer DNA door een gel beweegt, worden de fragmenten op basis van grootte gescheiden: kleine fragmenten bewegen sneller dan grote fragmenten.

De DNA-fingerprint

Door elektroforese ontstaat een bandenpatroon dat vrijwel uniek is voor iedere persoon. Dit noemt men een DNA-fingerprint. Het wordt gebruikt in forensisch onderzoek, identificatie van slachtoffers en verwantschapsonderzoek.

Automatische elektroforese

Tegenwoordig maakt men gebruik van fluorescente labels en capillairen. Computers lezen vervolgens automatisch het DNA-profiel af, wat sneller en nauwkeuriger werkt dan de klassieke gelelektroforese.

Vaderschapsonderzoek en VNTR’s

Bij vaderschapsonderzoek onderzoekt men VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats). Dit zijn DNA-stukken waarin een bepaalde basenvolgorde meerdere keren wordt herhaald. Een kind krijgt één allel van de moeder en één van de vader. Daarom moet elk bandje in het DNA-profiel van een kind teruggevonden worden bij één van beide ouders. Ontbreekt een band bij de vermeende vader, dan is hij waarschijnlijk niet de biologische vader.